前言：本站為你精心整理了淺說VP2基因的克隆技術范文，希望能為你的創作提供參考價值，我們的客服老師可以幫助你提供個性化的參考范文，歡迎咨詢。

1材料與方法

病毒陽性病料從臨床患病豬的血清和肺臟中取樣，由本實驗室鑒定并保存。主要試劑及質粒DNA提取和質粒抽提試劑盒均購自天澤基因工程有限公司(北京);IPTG、Taq酶、dNTP、pMD18-T載體克隆試劑盒、T4DNAligase、各限制性內切酶均為TaKaRa公司產品;UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程有限公司;蛋白質Maker購自Fermentas公司;蛋白純化鎳柱購自公司;抗組氨酸抗體購自Sigma公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG抗體、ECL顯影試劑盒購自碧云天生物技術研究所;原核表達質粒pET32a(+)及大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)由本實驗室保存。引物設計根據GenBank中收錄的豬博卡病毒基因組序列比對結果(登錄號為GU902967-GU902971)，利用DNAStar和Primer5．0軟件設計了用于擴增豬博卡病毒vp2基因的特異性引物，在上游引物中引入BamHⅠ限制性內切酶位點，在下游引物中引入XhoI限制性內切酶位點，預計擴增片段為795bp。引物序列為:上游引物;下游引物下劃線表示酶切位點)。引物由大連寶生物工程有限公司合成。病毒DNA提取及PCR擴增取100mg陽性組織病料，加入1mlPBS緩沖液進行充分研磨，－20℃反復凍融3次，8000r/min離心10min，取上清液200μl，或取血清200μl進行病毒DNA抽提，提取方法參照病毒DNA提取試劑盒說明書。以提取的DNA樣品為模板，擴增體系為，模板DNA2.00μl，上、下游引物各1.00μl，Taq酶(5U/μl)0.25μl，用滅菌蒸餾水補充至50.00μl體系。反應條件為:94℃預變性個循環;72℃延伸10min。原核表達質粒的構建及鑒定按DNA膠回收試劑盒說明書回收PCR產物，用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ分別酶切回收的PCR產物和pET32a(+)質粒，切膠回收相應片段后，用T4DNA連接酶于16℃水浴連接過夜。將連接產物轉入大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，涂布于含氨芐青霉素的固體LB平板上，37℃培養過夜。挑取單個菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養基中，振蕩培養，提取質粒并進行酶切鑒定，篩選出陽性質粒，送大連寶生物工程有限公司測序。重組質粒在大腸桿菌中的表達及SDS-PAGE分析將獲得的陽性重組質粒(宿主菌BL21)按1%接種LB液體培養基(含氨芐青霉素)中，于37℃振蕩培養至OD600為0．5～0.7時，加入IPTG至終濃度為100mmol/L，誘導表達目的蛋白，并分別在培養3h和5h時取1ml菌液，同時收集未誘導的菌液作為陰性對照，對經轉化BL21的空載體也以相同的條件誘導，作為對照。用12%的SDS-PAGE檢測重組蛋白。重組蛋白表達產物的純化誘導表達50ml重組菌，收集菌液，超聲裂解后，12000r/min離心20min后收集上清液，用鎳柱對融合蛋白進行親和純化，將純化后的融合蛋白進行12%SDS-PAGE電泳分析。重組蛋白的Westernblot鑒定對誘導5h的重組菌進行Westernblot檢測鑒定。蛋白樣品經SDS-PAGE電泳后轉移至硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉，以抗組氨酸抗體為一抗，HRP酶標羊抗鼠IgG抗體為二抗，加入ECL底物顯色液，室溫作用5～10min至顯色充分，用雙蒸水終止反應，拍片觀察并保存。

2結果

對PCR產物回收后進行連接、轉化，對重組質粒pET32a-VP2用BamHⅠ和XhoI進行酶切鑒定，結果顯示，除載體片段外，還出現了795bp的條帶，其大小與預期結果一致。測序結果表明VP2序列與Gen-Bank中豬博卡病毒的VP2基因序列完全相同，表明重組質粒構建正確。(DE3)中經IPTG誘導后，經SDS-PAGE電泳分析發現，與空載體pET32a(+)的菌液相比，重組質粒的誘導菌在大小49000處出現一條較粗的蛋白條帶，大小與融合蛋白的理論值一致，隨著誘導時間的增加，其表達量也隨之增加。而未誘導的重組質粒轉化菌和空載體質粒轉化菌均沒有出現相同的條帶。擴大培養后，收集細菌，經超聲破碎及離心分離沉淀和上清，分別進行SDS-PAGE，結果顯示重組蛋白主要存在于上清中，表明蛋白表達產物以可溶性形式存在為主。進一步利用鎳柱對其純化，得到一條大小49000的清晰條帶，與預期相符重組蛋白的表達、鑒定與純化重組表達質粒pET32a-VP2在大腸桿菌BL212．

3表達產物的Westernblot檢測

建立一種快速、敏感、簡便的血清學檢測方法成為當務之急。本研究構建了重組質粒pET32a-VP2，并在大腸桿菌中成功表達了豬博卡病毒的VP2蛋白。結果表明，經IPTG誘導后，重組蛋白有很高的表達量，且以可溶性蛋白形式存在;經過柱純化后，該蛋白純度較高;經Westernblot鑒定，證明該蛋白具有很x好的反應原性。目前研究結果都表明VP2蛋白可作為診斷抗原的候選蛋白。因此，本研究為進一步深入研究豬博卡病毒VP2蛋白的結構與功能奠定了基礎，同時為建立血清學診斷方法，如間接ELISA方法和膠體金免疫層析試紙條等提供了候選蛋白。

作者：李彬杜露平何孔旺單位：江蘇省農業科學院