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本文作者：喬瑩、蔡鑫澤、趙連爽、陳冬、劉穎單位：中國醫科大學附屬第一醫院中心實驗室、沈陽軍區第二零二醫院綜合內科

也稱貝氏柯克斯體,是細胞內生短小桿菌(圖1),其在酸性條件下代謝旺盛、在細胞漿的Endsome內繁殖,形成內封入體。C.b是Q熱的病原菌,Q熱是分布最廣的人獸共患傳染病之一[12]。由于Q熱在臨床上無特異癥狀和體征,因而與其他熱性傳染病難以鑒別,誤診率極高,應引起足夠重視Q熱分為急性Q熱和慢性Q熱。急性Q熱多有報道,慢性Q熱死亡率高難以治愈。鑒于Q熱患者的臨床表現多種多樣,一般以發熱、咳嗽、頭痛、肌肉酸痛為主要癥狀,并常伴有肺炎、肝炎、心內膜炎、大動脈瘤等,與其他立克次體病的不同之處是無皮疹及外斐氏反應陰性。在缺乏實驗室檢查和流行病學資料分析往往未被重視的情況下,Q熱的誤診和漏診相當嚴重。世界范圍內Q熱的發病率呈上升趨勢,感染途徑不明的病例增多,有報道稱與寵物增多呈正相關,我們從食品安全的角度,驗證雞蛋是否是潛在的Q熱傳染源之一[35]。

1材料與方法

1.1Coxiellaburnetii(C.b)菌PCR標準品及陽性對照CoxiellaburnetiigenomeDNA來源于NineMillII相菌,用引物OPM1:(5′-AGTAGAAGCATCCCAAGCATTG-3′)和OPM4:(5′-TTGGAAGTTATCACGCAGTTG-3′),進行PCR反應:95°C30s;95°C5s,55°C30s,72°C30s,共40個循環。應得到27kD外膜蛋白Com1基因的501bp的DN段。用膠DNA回收試劑盒(TaKaRa)回收501bpDN段后,測定DNA濃度,系列稀釋作為標準品用于定量PCR反應。

1.2主要儀器PCR及巢式PCR反應使用ABIGeneAmpPCRsystem9700;定量PCR使用Corbett,測序儀使用ABI3130GeneticAnalyzer,熒光顯微鏡使用NIKON。

1.3試劑(1)PBST(g/L):NaCl8,Na2HPO42.89,KCl0.2,KH2PO40.2,Tween-201mL。(2)洗凈液:10mmol/LTris緩沖液(pH7.2)含有0.5%NP-40,0.25%Tween-20。

1.4實驗方法

1.4.1雞卵總DNA提取方法:先取約1/9雞卵黃,用40mLPBST稀釋后、用2000r/min離心30min去沉淀,取上清再用10000r/min高速離心30min后取沉淀,沉淀用洗凈液2mL洗凈離心2次,將沉淀放入80°C冰箱冷凍20min,解凍反復操作3次后,用含有50mg/L蛋白消化酶K的裂解液(Promega,E397A)200μL,56°C2h消化處理后[6],用磁珠法提取DNA(TOYOBO,NPK-501)。

1.4.2定量PCR測定:引物OPM1(5′-AGTAGAAGCATCCCAAGCATTG-3′)和OPM3(5′-GAAGCGCAACAAGAAGAACAC-3′),應得到27kD外膜蛋白Com1基因的472bp的DN段。將上述雞卵總DNA提取物的1/30(2μL),按照TaKaRaSYBRPremixExTaqTMII試劑盒說明書操作,PCR反應條件為:95°C30s;95°C5s,55°C30s,72°C30s,共40個循環。2%瓊脂糖電泳后,確認產物為472bp的片段[7]。

1.4.3巢式PCR:引物OPM2(5′-TGCCTGCTAGCTGTAACGATTG-3′)和OPM3(5′-GAAGCGCAACAAGAAGAACAC-3′),應得到27kD外膜蛋白Com1基因的438bp的DN段。100μL體系含有:10×反應緩沖液10μL、2.5mmol/LdNTPs8μL、25mmol/LMgCl212μL、每種引物為80mmol/L0.8μL、Taq酶0.4μL,定量PCR反應產物2μL,用純凈水加到100μL。反應條件為:95°C5min;95°C30s,58°C30s,72°C90s,共30個循環。2%瓊脂糖電泳后,確認產物438bp片段[8]。1.4.4PCR產物測序:用2%瓊脂糖電泳后,切膠回收DN段,精制試劑盒精制PCRDN段產物,以OPM2為引物用直接測序法測定精制PCRDN段產物[9]。1.4.5雞血球免疫熒光染色:用肝素抗凝抽取雞血涂片并固定,用抗C.bCom1表面蛋白單克隆抗體稀釋2000倍作為一抗染色37°C、2h洗凈后,再用兔抗鼠熒光標識抗體稀釋5000倍做為二抗染色后洗凈,用光學及熒光顯微鏡照相。

2結果

2.1定量PCR加巢式PCR法測定C.b菌基因的感度用OPM1和OPM3作為C.b定量PCR反應引物,用C.b菌PCR標準品作為模板,標準曲線R2達到0.999。用OPM1和OPM3作為引物進行定量PCR反應,反應產物為472bp長度的DN段,可測出大約40個C.b基因片段;在定量PCR的基礎上,用OPM2和OPM3進行巢式PCR反應,反應產物為438bp長度的DN段,可以在定量PCR的感度基礎上增加10倍,可測出大約4個C.b基因。

2.2實際雞卵的C.b菌DNA含量圖2為實際從雞卵中提取總DNA,進行定量PCR反應的部分電泳圖。可見29、66、125、169、150、164號雞卵為陽性,特異片段長度為472bp。定量PCR測定雞卵可能保有的C.b菌量(表1),推算一個雞卵黃中可能含有的C.b分子數,從104到106不等。它們中有2個PCR片段測序失敗,其余6個片段測序皆為C.bCom1基因的一部分,其中150號基因有變異(表2)。

2.3雞卵C.b菌DN段的測序及突變位點的確定用上游及下游引物同時測序定量PCR472bp片段,雞卵黃DNACom1基因PCR產物測序結果中,與Ninemile菌株同部位基因相比的突變位點。表2中表示的突變位點是分別用上游引物與下游引物直接測序后,同時發生變異的位點,同時該位點沒有其他可疑堿基峰出現。帶下劃線的堿基字母表示與Ninemile菌株同位點有變異;帶下劃線的氨基酸表示突變氨基酸。與Ninemile菌的Com1基因相比,有12個雞卵C.bCom1基因有突變出現,其中8個引起氨基酸突變,4個突變為氨基酸靜止性突變。有4個雞卵呈現2個以上的突變位點,1個雞卵中最多可測到4個突變位點,有2個氨基酸突變(表2)。

2.4雞血涂片間接特異性抗體免疫熒光染色光學顯微鏡下可見雞紅血球為有核均勻橢圓形,白血球為不規整形有核;熒光顯微鏡下可見同一圖像的白血球內有多數密集的熒光顆粒存在,確認為C.b內封入體(圖3)。

3討論

我們用定量PCR加上巢式PCR法可以使PCR反應感度增加10倍左右,用一般PCR反應產生501bp片段產物,通過膠回收法回收該片段,定量DNA濃度,以10倍系列稀釋該DNA產物并作為模板,用上述定量PCR加巢式PCR法反應,定量PCR反應階段可測出40個Com1基因[10],加上巢式PCR反應最多可測出4個Com1基因片段。理論上,如果C.b的整個基因只含有一個PCR特異性反應位點,并且整個基因做為底物與PCR產物做為底物的PCR反應差異可以忽略,那么用定量PCR加巢式PCR反應可以測出4個C.b菌的存在。實際上我們用上述定量PCR法,應用于雞卵中,僅測出104左右的C.b菌。感度降低了數百倍,可能是由于雞卵中提取的DNA雜質較多,并且卵黃中的高蛋白高卵磷脂可能是影響PCR反應的主要原因。用定量PCR反應測定雞卵中的C.b菌Com1基因數量,在標準品的選用上,我們沒能直接用C.b基因做為標準品,是由于C.b是細胞內菌,沒有準確的定量方法,同時整體基因達2000kb左右,計數誤差大,不準確。用501bpPCR反應產物為標準品,反應體系標準曲線R2高達99.99,曲線完美。我們用此方法推測一個雞卵中的C.b菌基因數可達到106左右。我國也對C.b的檢測做了大量的工作,亞紅祥等[11]通過TaqMan實時定量PCR法對ISlllla基因檢測可以檢出10個基因數左右,并且他們用ISlllla基因片段(485bp)克隆質粒DNA模板作為標準品,相對于我們用PCR產物作為標準品來說,更具有說服力,為今后標準品的改進提供了方法學依據。我們分別測定了Com1基因的PCR反應產物的序列,發現有突變菌株。從Com1的97號到177號共80個氨基酸序列中,有8個雞卵的C.bCom1基因發生變異,14個發生基因變異。我們選定變異菌株的條件是,一定用Forward及Reverse雙側引物分別測序并予以重復實驗,在同一位點發生同一樣變異的序列定為變異菌株,變異菌株也反證了雞卵中C.b菌存在的真實性;我們也對C.b陽性雞卵進行濃縮后,對免疫缺陷(SCID)鼠進行了動物實驗,鼠臟器免疫組織化學染色結果表明為陽性(結果待發表),因此,我們確信本研究結果的真實性。為了佐證雞可以感染C.b,我們捉取雞身上的寄生蟲、雞螨蟲等30個抽提DNA并進行PCR測定發現,C.bPCR陽性的占50%左右(結果未顯示)。我們對雞血涂片進行了大量的熒光染色測定,發現雞白細胞中可以感染C.b菌,并能增殖。C.b菌在單核細胞或巨噬細胞內繁殖,雞白細胞內確認到C.b菌證明C.b菌可以感染雞,由于其寄生生物提取DNAC.bCom1基因PCR反應陽性,因此通過螨蟲感染傳播的可能性極大。以前有報道在雞卵黃中可以分離到幽門螺菌,并證明有致病性,因此,我們推測雞卵中的C.b菌也應該具有感染性。而最終能否從雞卵中分離并培養出有生物活性的C.b菌是確定雞卵是否是C.b菌感染源之一的唯一必要條件,鑒于C.b菌是細胞內菌,培養困難,還需要進一步的研究[1214]。