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本文作者：唐潔1,2王海燕1,2徐巖1,2

作者單位：1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2.江南大學(xué)

傳統(tǒng)固態(tài)白酒的發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的多種微生物生物轉(zhuǎn)化的過程,酵母在其中起著重要作用。根據(jù)酵母的作用,大致可將酵母分成兩大類。一類是Saccharomycescerevisiae,主要完成酒精發(fā)酵,具有較高的發(fā)酵速率和完全的發(fā)酵能力。另一類是non-Saccharomyces,雖然其發(fā)酵效率較低,但能夠合成多種酶,將原料中的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)換成風(fēng)味物質(zhì)如酯、酸、高級(jí)醇和醛等產(chǎn)物,對(duì)發(fā)酵食品風(fēng)味、質(zhì)地和色澤的形成有著重要的作用。并且還能抑制發(fā)酵過程中一些腐敗微生物的繁殖[13]。與單獨(dú)培養(yǎng)相比,酵母的混菌發(fā)酵,能表現(xiàn)出更好的特性。它們或者代謝產(chǎn)生、增強(qiáng)一些有益的風(fēng)味化合物如苯乙醇、乙酸苯乙酯等,或者降解某些異味物質(zhì)如乙酸、乙醛等,或者促進(jìn)酵母的代謝性能,從而最終改變發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味特征[45]。所以將釀酒酵母和非釀酒酵母共同作為發(fā)酵起始菌種,為豐富發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味復(fù)雜性和增強(qiáng)風(fēng)格的獨(dú)特性提供了一條有效的途徑[67]。在詳細(xì)剖析葡萄酒發(fā)酵中的微生物組成后,研究的熱點(diǎn)之一就是釀酒酵母與非釀酒酵母組合發(fā)酵中酵母之間的相互影響和代謝產(chǎn)物的差異分析。白酒生產(chǎn)具有自身特殊的原料、工藝和微環(huán)境,需要重新認(rèn)識(shí)白酒中釀酒酵母與非釀酒酵母在生理和代謝水平上的相互作用。已發(fā)現(xiàn)的非釀酒酵母主要包括Pichia、Saccharomycopsis、Issatchenkia、Candida、Hanseniaspora[8]。畢赤類酵母是主要的產(chǎn)酯酵母,對(duì)白酒的風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)。其中,Pichiaanomala是白酒中普遍存在的菌種。異常畢赤酵母能耐受低pH、低水活度、高滲透壓、厭氧等極端環(huán)境。相比有氧,限氧條件不僅能夠誘導(dǎo)異常畢赤酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵,激活發(fā)酵途徑中的關(guān)鍵酶,而且對(duì)葡萄糖的吸收率和乙醇、甘油、乙酸乙酯等代謝物含量都有所增加[910]。國內(nèi)學(xué)者雖然對(duì)酵母的產(chǎn)酯作用進(jìn)行了諸多研究,但主要針對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件下單菌種的優(yōu)化[11],在釀酒環(huán)境中酵母產(chǎn)酯和酒精發(fā)酵的相互影響及協(xié)調(diào)作用研究很少。雖然白酒生產(chǎn)是固態(tài)發(fā)酵,但在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬白酒固態(tài)發(fā)酵工藝,存在著發(fā)酵、菌體生長、營養(yǎng)物的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌在各處的不均勻性,以及明顯的濃度梯度及傳熱、傳質(zhì)困難,使得發(fā)酵參數(shù)的檢測(cè)和控制比較困難。因此本研究嘗試在限氧條件下先實(shí)現(xiàn)釀酒酵母和異常畢赤酵母的混菌液態(tài)發(fā)酵,實(shí)現(xiàn)不同種屬酵母的組合發(fā)酵,并初步分析兩株酵母之間的相互作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種:釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和異常畢赤酵母(Pichiaanomala)為本實(shí)驗(yàn)室從酒醅中分離到的菌株,兩株菌采用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基斜面保養(yǎng)。

1.1.2培養(yǎng)基:種子培養(yǎng)基為麥芽汁培養(yǎng)基;發(fā)酵培養(yǎng)基為麩皮汁培養(yǎng)基[12]。

1.1.3試劑及藥品:2-辛醇(2-Octanol)、4-甲基-2-戊醇(4-Methyl-2-pentanol)購自Sigma公司。其他試劑均為國產(chǎn)色譜純或分析純,購于上海生工生物工程公司。

1.2方法

1.2.1液態(tài)發(fā)酵方式:將異常畢赤酵母和釀酒酵母單獨(dú)接種麩皮汁培養(yǎng)基,搖瓶培養(yǎng)1d后,按107CFU/mL接種量接入100mL麩皮汁培養(yǎng)基中于30°C靜置培養(yǎng)6d。兩株酵母混合發(fā)酵是采用兩種方式接種:①分別單獨(dú)液態(tài)培養(yǎng)1d后,按照1:1比例接種(混合接種);②根據(jù)兩種酵母的生長曲線,由于異常畢赤酵母生長較為緩慢,需要近10h才能達(dá)到與釀酒酵母相同的生長量。故麥芽汁培養(yǎng)基中先接種異常畢赤酵母,培養(yǎng)10h,再接入釀酒酵母(順序接種)。種子液搖瓶培養(yǎng)1d后,按107CFU/mL接種量接入麩皮汁培養(yǎng)基于30°C培養(yǎng)箱中恒溫靜置培養(yǎng)6d。每隔24h取樣,測(cè)定不同培養(yǎng)方式下發(fā)酵液的理化指標(biāo)、酵母的發(fā)酵性能和產(chǎn)酯能力,跟蹤發(fā)酵過程中兩種酵母數(shù)量變化趨勢(shì);并檢測(cè)發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液的風(fēng)味物質(zhì)。

1.2.2發(fā)酵液理化指標(biāo)的測(cè)定:pH測(cè)定采用METTLERTOLEDOpH計(jì),還原糖采用DNS法測(cè)定[13]。發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中乙醇、葡萄糖用HPLC測(cè)定[14]。乙醇理論轉(zhuǎn)化率=乙醇濃度/(0.51×還原糖濃度)×100%,其中糖轉(zhuǎn)換為乙醇的換算系數(shù)為0.51[15]。

1.2.3酵母計(jì)數(shù):因?yàn)閮煞N酵母在YPD平板上的形態(tài)不同,直接采用稀釋涂布YPD平板測(cè)定發(fā)酵過程中兩種酵母的數(shù)量變化。

1.2.4酵母發(fā)酵性能:采用CO2失重法。每隔24h稱重一次,直至發(fā)酵結(jié)束。

1.2.5乙酸乙酯的檢測(cè):采用液-液微萃取法提取和氣相色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器(GC-FID)定量分析。取5mL發(fā)酵液于離心管中,加入5μL內(nèi)標(biāo)(2-辛醇)溶液和500μL乙醚。充分混勻后靜置分層,取有機(jī)相進(jìn)行分析(儀器為安捷倫6890N氣相色譜儀配有氫火焰離子化檢測(cè)器FID)。色譜條件見文獻(xiàn)[16]。

1.2.6發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)的分析:運(yùn)用頂空固相微萃取技術(shù)(HS-SPME)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)方法分析。樣品處理方法及GC-MS分析條件見文獻(xiàn)[17]。

1.2.7無細(xì)胞濾液對(duì)酵母生長的影響:麩皮汁中發(fā)酵4d酵母發(fā)酵液,離心收集上清,0.22μm微孔膜過濾除菌獲得無細(xì)胞濾液[18]。在無細(xì)胞濾液中添加等體積的葡萄糖溶液和新鮮麩皮汁培養(yǎng)基。將培養(yǎng)好的酵母(107CFU/mL)接入上述培養(yǎng)基中,于30°C靜置培養(yǎng)24h后測(cè)OD600。對(duì)照分別為酵母接入不接種麩皮汁培養(yǎng)基+新鮮麩皮汁培養(yǎng)基(1:1)和不接種麩皮汁培養(yǎng)基+葡萄糖溶液(1:1)。

2結(jié)果與討論

2.1酵母數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化及發(fā)酵性能的測(cè)定

發(fā)酵過程中酵母總數(shù)的動(dòng)態(tài)變化見圖1。發(fā)酵前48h,酵母處于快速生長階段,在4896h保持較高數(shù)量,此后數(shù)量緩慢減少。釀酒酵母和異常畢赤酵母單菌種培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞數(shù)可達(dá)到1.6×108CFU/mL和8.3×107CFU/mL,而混菌發(fā)酵時(shí)細(xì)胞量最大也能達(dá)到108CFU/mL。畢赤酵母單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞數(shù)一直位于最低水平?；炀l(fā)酵時(shí),由于釀酒酵母的存在,體系中酵母總數(shù)很快達(dá)到較高水平。混菌發(fā)酵過程中兩種酵母數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化過程見圖2。順序接種混菌培養(yǎng)時(shí)異常畢赤酵母數(shù)量始終高于混合接種混菌培養(yǎng),而釀酒酵母情況卻相反。由于混菌發(fā)酵時(shí)兩種酵母競(jìng)爭(zhēng)利用碳源,釀酒酵母優(yōu)先利用葡萄糖而迅速增殖,異常畢赤酵母營養(yǎng)不足導(dǎo)致生長緩慢,故混合接種時(shí)釀酒酵母數(shù)量較高。當(dāng)異常畢赤酵母先單獨(dú)培養(yǎng)時(shí),沒有競(jìng)爭(zhēng)壓力,生長到一定的生物量后再接入釀酒酵母,使兩種酵母共同繁殖,獲得較高的細(xì)胞水平。所以,順序接種時(shí)異常畢赤酵母數(shù)量較高。這與葡萄酒中釀酒酵母與非釀酒酵母混菌發(fā)酵的結(jié)果相一致[19]。此外,當(dāng)兩種酵母在同一體系中共同發(fā)酵時(shí),由于營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間的限制,各自的最大生物量都低于單菌種培養(yǎng)的水平[1920]。普遍認(rèn)為在與釀酒酵母混合發(fā)酵時(shí),非釀酒酵母會(huì)抑制釀酒酵母的發(fā)酵性能[20]。混菌發(fā)酵的結(jié)果也驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。如圖3所示,順序接種混合發(fā)酵時(shí)異常畢赤酵母的存在,主要是降低了起始階段的發(fā)酵速度,48h后發(fā)酵速度恢復(fù)到單菌種的水平。而混合接種發(fā)酵整個(gè)系統(tǒng)的發(fā)酵能力與釀酒酵母單菌種培養(yǎng)相近,CO2失重兩者之差不超過2g。單菌種培養(yǎng)與混菌發(fā)酵中乙酸乙酯濃度的變化規(guī)律見圖4。發(fā)酵48h時(shí)乙酸乙酯含量都達(dá)到峰值,最高為1.5g/L(順序混菌接種)。釀酒酵母產(chǎn)酯能力很弱,發(fā)酵液中乙酸乙酯濃度始終低于0.05g/L。由于混合接種混菌發(fā)酵中異常畢赤酵母的數(shù)量偏低,所以發(fā)酵液中乙酸乙酯也較低。雖然順序接種混菌發(fā)酵中異常畢赤酵母數(shù)量低于該酵母單菌種培養(yǎng),但發(fā)酵后期前者發(fā)酵液中乙酸乙酯含量更高。這可能是由于釀酒酵母的存在,提高了發(fā)酵液中乙醇濃度,促進(jìn)非釀酒酵母的酯合成活性[21]。根據(jù)發(fā)酵體系重要的功能參數(shù)——發(fā)酵力和乙酸乙酯含量判斷,順序接種混菌發(fā)酵方式中兩種酵母都能達(dá)到較高的生物量,完成酒精發(fā)酵,合成了大量的乙酸乙酯。

2.2發(fā)酵過程理化指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化

發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH的變化如圖5A所示。發(fā)酵1d時(shí)pH急劇下降,23d中pH值逐步上升,此后基本維持不變。單菌種與混菌發(fā)酵pH值的變化趨勢(shì)一致。發(fā)酵初期酵母形成乙酸等酸性物質(zhì),導(dǎo)致pH的降低。經(jīng)過初期的繁殖,酵母轉(zhuǎn)入酒精發(fā)酵階段,其分泌的蛋白酶水解蛋白質(zhì)生成氨基酸,氨基酸脫氨作用生成NH3。并且發(fā)酵液中酒精濃度不斷上升,造成pH值的上升[22]。發(fā)酵結(jié)束時(shí),兩種混菌方式和單菌種發(fā)酵各自pH值變化不大。還原糖是判斷酵母生長的重要指標(biāo)。由圖5B可見,酵母的生長需利用還原糖,還原糖含量迅速下降。發(fā)酵48h時(shí),混菌發(fā)酵和釀酒酵母單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)發(fā)酵液中還原糖含量已降至10g/L左右。而異常畢赤酵母單獨(dú)培養(yǎng)時(shí),生長速度緩慢,需發(fā)酵72h后還原糖才降至10g/L左右。隨后,酵母數(shù)量緩慢減少,還原糖含量趨于平穩(wěn)。

2.3發(fā)酵產(chǎn)物相關(guān)指標(biāo)分析

發(fā)酵6d后,比較了混菌與單菌種發(fā)酵時(shí)相關(guān)理化指標(biāo)的差異。由表1可知,異常畢赤酵母單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)乙醇含量較低,乙酸乙酯含量為0.41g/L;釀酒酵母發(fā)酵液中乙醇濃度為22.20g/L,乙酸乙酯濃度僅有0.03g/L。所以,異常畢赤酵母與釀酒酵母分別具有較好的產(chǎn)酯和酒精發(fā)酵能力。組合兩種酵母進(jìn)行混菌發(fā)酵,影響了整體的酯合成和酒精發(fā)酵水平。從殘?zhí)呛推咸烟菨舛瓤梢钥闯?混菌發(fā)酵時(shí)酵母對(duì)糖的利用程度與釀酒酵母相當(dāng)。雖然順序接種混菌發(fā)酵的乙醇濃度和理論轉(zhuǎn)化率比釀酒酵母單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)降低了約10%,但乙酸乙酯產(chǎn)量增加顯著,比異常畢赤酵母純種發(fā)酵時(shí)乙酸乙酯含量提高了近80%。因此,順序接種混菌發(fā)酵保證了發(fā)酵的可行性。

2.4發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)的分析

酵母在發(fā)酵過程中能代謝產(chǎn)生一些次級(jí)代謝產(chǎn)物,如高級(jí)醇類、酸、酯等,這些物質(zhì)對(duì)白酒的風(fēng)味具有重要的貢獻(xiàn)作用。因此,用GC-MS測(cè)定了發(fā)酵液中主要的風(fēng)味物質(zhì)。測(cè)定結(jié)果見表2(因檢測(cè)到的醛、酮類物質(zhì)含量極低,數(shù)據(jù)未列出)。酸類物質(zhì)中以乙酸為主。乙酸是非釀酒酵母代謝的副產(chǎn)物,含量過高會(huì)形成異味[23]。異常畢赤酵母單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的乙酸含量最多,是釀酒酵母的3.25倍。乙酸是合成酯的前體物質(zhì),混菌時(shí)異常畢赤酵母能將較多的酸轉(zhuǎn)化成酯。所以,混菌發(fā)酵有效地減少了乙酸濃度。高級(jí)醇主要是酵母繁殖的過程中形成的,釀酒酵母合成高級(jí)醇的能力強(qiáng)于非釀酒酵母。單菌種培養(yǎng)時(shí),釀酒酵母產(chǎn)生的高級(jí)醇是異常畢赤酵母的2.43倍。與釀酒酵母單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)相比,混合接種發(fā)酵時(shí)高級(jí)醇含量提高了28%。推測(cè)可能是非釀酵母在發(fā)酵后期的自溶,為釀酒酵母提供營養(yǎng)物質(zhì)?；蛘叻轻劸平湍妇哂心承┟富?能夠?yàn)獒劸平湍柑峁I養(yǎng)來源[23]。但順序接種發(fā)酵的高級(jí)醇含量卻降低了31%。這不僅與發(fā)酵體系中酵母的數(shù)量有關(guān),而且可能是由于非釀酒酵母將高級(jí)醇轉(zhuǎn)化成酯類物質(zhì)[24]。發(fā)酵液中酯類物質(zhì)主要是醋酸酯和乙酯,它們都是白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)。釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生了較多的乙醇,異常畢赤酵母以酯酶合成途徑將醇和酸轉(zhuǎn)化為酯[21]。所以混合發(fā)酵中總酸和高級(jí)醇含量都相對(duì)較低,酯類相對(duì)較高。4種發(fā)酵液中檢測(cè)出的主要醋酸酯為乙酸乙酯和乙酸苯乙酯,異常畢赤酵母純種發(fā)酵、釀酒酵母純種發(fā)酵、順序接種混合發(fā)酵和混合接種混菌發(fā)酵中乙酸酯總和分別占相應(yīng)總酯含量的52.53%、27.67%、66.08%和65.55%。相比單菌種發(fā)酵,混菌發(fā)酵有效地提高了發(fā)酵液中醋酸酯。發(fā)酵體系中有機(jī)酸含量低,使得混菌和單菌種發(fā)酵時(shí)其他乙酯類的含量都偏低。

2.5無細(xì)胞系統(tǒng)酵母菌相互影響觀察

在混菌發(fā)酵時(shí),酵母會(huì)競(jìng)爭(zhēng)利用有限的營養(yǎng)物質(zhì)(主要是碳源),也會(huì)分泌代謝產(chǎn)物抑制或誘導(dǎo)其他真菌的死亡[10,25]。鑒于碳源和代謝物對(duì)酵母的抑制作用,將酵母菌株培養(yǎng)在麩皮汁/葡萄糖溶液+酵母無細(xì)胞濾液中,以無細(xì)胞濾液/對(duì)照組的生長相對(duì)值來表示酵母生長受抑制的程度。由表3可知,在無細(xì)胞濾液中添加麩皮汁時(shí),釀酒酵母的生長受到一定程度的抑制;但添加葡萄糖溶液時(shí),基本未表現(xiàn)出抑制效應(yīng)。說明兩種酵母的代謝產(chǎn)物對(duì)釀酒酵母都無生長抑制作用,碳源是影響釀酒酵母繁殖的重要因素。而對(duì)于異常畢赤酵母,不管是添加麩皮汁還是葡萄糖,該酵母都受到了無細(xì)胞濾液的抑制,且抑制程度處于相似水平。因此,代謝物抑制作用是影響異常畢赤酵母生長的主要因素。3結(jié)論與展望本實(shí)驗(yàn)在限氧條件下以谷物為培養(yǎng)基,采用釀酒酵母與異常畢赤酵母的混合發(fā)酵,分析其對(duì)發(fā)酵效率和風(fēng)味物質(zhì)的影響。異常畢赤酵母易受自身和釀酒酵母代謝物的抑制,生長較為緩慢。故混菌發(fā)酵時(shí)采用順序接種混菌培養(yǎng),使異常畢赤酵母先開始繁殖,削弱了代謝抑制作用,使異常畢赤酵母生長速率提高,此后再接種釀酒酵母。由于酵母之間對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間的競(jìng)爭(zhēng)性利用和酵母代謝產(chǎn)物的抑制作用,導(dǎo)致兩株酵母生物量都未達(dá)到各自純培養(yǎng)時(shí)的水平。但發(fā)酵結(jié)束時(shí),整體發(fā)酵水平下降不到10%,乙酸乙酯含量提高了80%。因此,混菌發(fā)酵時(shí)雖然酵母數(shù)量減少,但細(xì)胞代謝活性卻增加。混合發(fā)酵時(shí),釀酒酵母增加了發(fā)酵液中乙醇含量,底物濃度的增加隨之促進(jìn)了酯的合成。發(fā)酵結(jié)束時(shí)風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果表明,順序接種混菌發(fā)酵能有效地利用發(fā)酵液中的酸類物質(zhì)和高級(jí)醇,合成更多的酯類化合物。葡萄酒發(fā)酵過程中,在起始階段存在較高數(shù)量的Non-Saccharomyces,此后釀酒酵母開始繁殖。釀酒酵母產(chǎn)生蛋白類代謝物抑制Non-Saccharomyces的生長,Non-Saccharomyces的數(shù)量迅速下降[25]。但模擬白酒生產(chǎn)條件進(jìn)行酵母的混合發(fā)酵時(shí),釀酒酵母主要是抑制了起始異常畢赤酵母的生長,發(fā)酵過程中異常畢赤酵母仍能維持較高水平,直至發(fā)酵結(jié)束。因此,長期白酒環(huán)境的馴化、以及不同的原料和發(fā)酵條件可能改變了酵母的生長、代謝特性,白酒中酵母的相互作用具有自身的特殊性,需要進(jìn)行深入的探索。

綜上所述,將釀酒酵母與非釀酒酵母進(jìn)行混菌發(fā)酵,在保證酵母釀造性能不變的前提下,對(duì)于提高發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味特征具有明顯的作用。酵母之間的生長抑制和微量組分協(xié)同合成作用,將影響發(fā)酵過程中酵母的生長性能和產(chǎn)品的風(fēng)格特征。酵母的相互作用為工業(yè)條件的優(yōu)化提供了依據(jù)。