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本文作者：范維偉孫慧君蔡超俊袁瑋韓國柱作者單位：大連醫科大學藥學院

實驗部分

1外源性pcr對小鼠全腦永久性缺血損傷的影響

(1)動物分組、給藥及模型制備:小鼠60只，隨機分為對照組、PCr高劑量組(4．5g•kg－1)、PCr低劑量組(1．5g•kg－1)，每組20只。腹腔注射給藥，容量0．1mL•10g－1體重，對照組給予等容量NS。于給藥20min后用大組織剪沿小鼠雙耳連線下部快速斷頭，制備全腦永久性缺血模型。

(2)標本處理及指標測定:每組取10只于斷頭即刻記錄張口喘息持續時間。另10只于動物斷頭20s取大腦，一側半球制備10%腦組織勻漿，嚴格按照試劑盒說明書測定蛋白濃度(考馬斯亮藍法)、SOD活力(黃嘌呤氧化酶法)及MDA含量(TBA法)。另側腦半球經10%福爾馬林固定，常規制備石蠟片HE染色。

2外源性PCr對小鼠全腦缺血再灌注損傷的影響

(1)實驗分組、給藥及模型制備:小鼠50只，隨機分為假手術組、模型組、PCr高劑量組(2．0g•kg－1)、低劑量組(1．0g•kg－1)組及尼莫地平(Nim)組，每組10只。NS及PGr分別以0．1mL•10g－1體重于首次缺血即刻1次尾靜脈注射，Nim組術前2d始灌胃給藥，2次/d，每次100mg•kg－1體重，手術當天術前30min末次給藥。按文獻［2］方法，小鼠麻醉，雙側頸總動脈(CCA)完全阻斷血流10min，復灌10min，重復3次，制備全腦缺血再灌注損傷模型。假手術組僅暴露CCA，不進行缺血再灌操作。不同處理組小鼠分別于末次再灌2h后斷頭取腦。

(2)標本處理及指標測定:每組取10只小鼠左側大腦測定腦組織含水量(干濕重法)腦含水量(%)=(濕重－干重)/濕重×100WesternBlot法測定CD14蛋白表達:每組取6只小鼠右側大腦組織經裂解液充分裂解后，4℃離心取上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度。12%SDS－PAGE分離膠，5%SDS－PAGE濃縮膠。樣品經處理后上樣，電泳、PVDF膜轉膜(恒流0．8mA/cm，室溫，48min)，5%脫脂奶粉封閉。Rabbitanti－RatCD14(1∶250)以及β－Actin抗體(1∶1000)孵育過夜(4℃)，二抗(1∶5000)37℃水浴孵育2h。ECL暗室顯色，凝膠成像系統拍照后Gel－ProAnalyzer4．0軟件分析。

3統計學方法

應用SPSS11．5統計軟件進行分析，數據用均數±標準差(x±s)表示。兩組間均數采用t檢驗;多組間均數樣本比較采用One－ANVOA方差分析;兩兩比較采用q檢驗，P＜0．05認為差異有顯著性意義。

結果

1外源性PCr對小鼠全腦永久性缺血損傷的影響高劑量

PCr可延長小鼠永久性全腦缺血后張口喘息持續時間、增加腦組織中SOD活力，與對照組比較P＜0．05。高、低劑量組小鼠腦組織中MDA含量均明顯低于對照組(P＜0．05)，見表1。

2外源性PCr對小鼠GBI/R損傷的影響

(1)外源性PCr對腦含水量的影響:與假手術組比較，GBI/R模型組腦含水量升高明顯(P＜0．05);給予外源性PCr及Nim處理后腦含水量低于模型組，差異具有顯著性意義(P＜0．05)，見表2。

(2)外源性PCr對腦組織中CD14蛋白表達的影響:WesternBlot法檢測顯示小鼠GBI/R后腦組織CD14蛋白表達明顯升高。不同劑量PCr處理可明顯降低CD14升高的程度。見表2，圖1。

(3)對腦組織病理變化的影響:經組織切片HE染色鏡下觀察，結果顯示假手術組神經細胞大小、形態結構完整，核大而圓無固縮，間質均勻致密;模型組可見大量神經細胞變性，胞核固縮、深染，細胞周圍間隙結構松散，出現大量空泡，PCr及Nim給藥組與模型組相比病變程度均明顯減輕。見圖2。

討論

急性腦缺血是臨床上常見的腦血管疾病之一，能量代謝障礙是導致細胞損傷的觸發因素，有效提供能量是缺血早期治療，減輕組織損傷的關鍵。本研究所用小鼠腦缺血性損傷模型具有良好的重現性，損傷指標明確。磷酸肌酸(phosphocreatine，PCr)是體內高能磷酸化合物的儲存形式，其分子中含高能量的氨基磷酸鍵，在細胞中水解可產生超過12000kal/mol能量，是細胞的重要能源物質［3］。在組織大量消耗ATP，導致ADP增多時，PCr可將其磷酸鍵轉移給ADP生成ATP以補充能量的供應，在生理及應激條件下通過此反應維持機體能量代謝的動態平衡［4－5］同時具有穩定磷脂膜、保護細胞免受自由基過氧化損害等作用［6］。近期有研究認為，PCr的作用方式可能有以下兩方面:(1)通過PCr分子起作用，其含有的高能磷酸鍵參與能量代謝，使ATP生成增加;(2)通過其體內代謝產物肌酸(creatine，Cr)發揮作用，在這種情況下，PCr作為Cr的一個前體藥物或載體而發揮作用［7］。腦缺血時可產生大量氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化作用，引起細胞損傷。此過程生成的MDA等脂質過氧化物的分解產物亦可造成細胞損傷。SOD清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷。將MDA與SOD配合測定，以反映機體氧化損傷和抗氧化能力是本類研究常用方法。諸多研究已證實，急性腦缺血時因中樞神經功能障礙導致植物神經功能紊亂，加之機體發生應激反應導致腸黏膜屏障功能受損，細菌移位、大量內毒素釋放并誘導細胞表面受體(CD14)表達增多，參與并加重組織損傷，甚至觸發多器官功能障礙綜合征的發生。本研究結果顯示外源性PCr可明顯延長全腦永久性缺血后張口呼吸時間;減輕腦水腫及損傷后腦組織形態學改變。顯示外源性PCr可有效緩解腦缺血性損傷，維持腦功能。而降低組織MDA含量、提高SOD活力;抑制損傷后CD14表達則提示PCr抗腦缺血性損傷作用可能通過增加供能、穩定細胞內腺苷酸池，穩定磷脂膜等機制，進而提高組織抗氧化性損傷能力及降低繼發性內毒素攻擊、保護細胞有關。本研究在一定程度上證實了在腦缺血早期給予外源性PCr可有效減輕腦組織缺血及缺血再灌注損傷，維持腦功能，并有可能減輕腦損傷繼發的其他組織器官損傷。為臨床用藥提供了實驗和理論依據。