干細胞培養技術
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干細胞培養技術范文第1篇
【中圖分類號】R691【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2009)10-0125-01
壓力性尿失禁(SUI)為女性的常見病和多發病，其發病率約為1 S%-6O%，多發生于老年人，因受經濟、宗教、教育程度等因素的影響，其實際發生率比統計發病率更高。SVl的癥狀嚴重與否都不自接危及生命，但它給患者的日常上作、生活及社交活動造成一定程度的影響，甚至會嚴重影響患者的生活質量乃至家庭和睦。
1臨床資料
注射療法是將藥物、化學制劑或自體組織等注入后尿道或膀肌頸內口粘膜下，使尿道腔變窄、拉長，延長功能性尿道的長度，提高尿道阻力，起到關閉尿道內口和后尿道的作用，從而達到有效控制排尿的口的。這一治療方法對尿道內括約肌功能障礙、尿道內壓降低同時尿道、膀肌無其他病變等壓力性尿失禁患者有較好的效果。注射療法主要優點在于.以在局部浸潤麻醉下進行操作，大多數患者的手術均.IJ.以在門診進行，適用于老年及不能耐一受大手術的患者。口前注射療法的研究主要集中在選擇不同的注射材料上，理想的注射材料應該在結構上完整，無毒、無免疫原性、無變應原性，近期內不會被分解，能長時間保持其支撐作用。口前使用的材料尚難達到上述要求，因此尋找一種取材方便、生物相容性好、安全無毒、療效滿意的注射材料十分必要。
方法：無菌技術下獲取SD大鼠雙側腹股溝區脂肪墊，消化離心，長期培養的方法獲取脂肪源性間充質干細胞。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化，對培養細胞進行免疫細胞化學染色，鑒定其表面分子標志。SD大鼠24只分為3組，實驗組（6只），對照組一（3只），對照組二（3只）。分別獲取自體ADSCs，實驗組進行熒光標記。然后實驗組將熒光標記的ADSCs自體移植至尿道周圍，對照組移植未并取尿道組織進行HE染色組織學分析。
2結果
原代培養顯示培養的脂肪源性間充質干細胞2d左右開始壁,10d-14d左右可達90%融合,基本上為梭形成纖維樣細胞形態,免疫細胞化學示 CD29陽性，CD34陰性。神經切斷術后10天，除模型組和對照組一各有1只大鼠死亡外，均進行尿流動力學檢測，三組手術前后ALLP分別為：對照組一為27.1±5.1和29.1±3.2cmH2O，對照二為29.5±4.9和27.4±72.3,模型組為24.8±3.8和14.7±3.0。模型組手術后ALLP明顯降低，且組織學檢查亦證明模型組大鼠尿道周圍括約肌明顯萎縮。
3討論
本實驗將熒光金標記的脂肪源性干細胞自體移植至大鼠的近端尿道周圍，行冰凍切片，組織化學染色，熒光顯微鏡下觀察.見熒光標記的細胞呈金黃色:后取組抗體免疫移植部位有較多的Desmin陽性的細胞，棕黃色，部分出現一定的方向性，未見明顯炎癥細胞浸潤，說明己有細胞在局部存活并生長，提示能成為壓力性尿失禁注射治療的一種理想的注射材料，為將來進行細胞移植治療壓力性尿失禁提供了實驗依據。
結論：①大鼠脂肪組織中含有豐富的多能干細胞。利用消化離心，長期培養的方法可獲取大量的干細胞。②移植后大鼠的ADSCs，可以在尿道周圍成活并生長分化。
參考文獻
[1]梁月有.診斷女性壓力性尿失禁的相關檢查[J].新醫學.2006,37（10）:687-689.
[2]王萌.尿道周圍注射治療女性壓力性尿失禁的研究進展[J].國際泌尿系統雜志,2006,26（6）：798-802.
[3]姚啟盛，葉章群，陳從波,等.骨胳肌肌源細胞自體移植在壓力性尿失禁治療中的價值[J].中華泌尿外科雜志，2006，26（12）:841-843.
干細胞培養技術范文第2篇
關鍵詞：信息技術；婦幼保健院；政工干部培養
信息技術是伴隨計算機和網絡技術的發展而發展的，如今信息技術已經進入了發展的全盛時期，信息技術的發展對人們的生活、學習及工作方式產生了廣泛而深刻的影響。在此背景之下，政工干部的培養工作也不免受到信息技術發展的影響，如何準確地把握信息技術發展水平及趨勢對于政工干部培養產生的影響，科學利用信息技術的強大功能來提高政工干部培養的質量，是所有企事業單位需要思考的問題，婦幼保健院也不例外。
一、信息技術發展對婦幼保健院政工干部培養的影響
1.信息技術發展對政工干部素質提出了更高的要求
信息技術的發展使得信息化素質成為政工干部的基本素質之一，婦幼保健院的政工干部也不例外。信息化素質是指主體所擁有的各種信息品質，包括信息智慧、信息道德、信息意識、信息覺悟、信息潛能和信息心理等內容。信息化素質能讓政工干部跟上時展的潮流，掌握最新的信息技術，也能讓政工干部認識到信息的重要性而自覺地利用信息提高工作質量，培養政工干部終身學習意識。婦幼保健院作為醫療體系的一部分，一些醫療技術和醫療設備更新速度很快，政工干部必須具備較高的信息化素質才能捕捉到這些信息。具體來說，信息技術的發展要求婦幼保健院的政工干部全面提高自身素質，學好信息知識、掌握信息技能的同時，還要學習政工理論知識、醫療專業知識及人文社科知識等，培養政工干部的領導管理能力、溝通交流能力等。
2.信息技術發展對政工干部素質培養提供了新的條件
信息技術的發展改變了傳統的信息的載體形式，拓寬了信息傳播的渠道，極大地縮短了信息傳播所需要的時間，使個人獲得信息的成本大大降低，為政工干部的培養創造了有利的條件。首先，政工干部學習、溝通渠道更廣。婦幼保健院可以在政工干部的培養課程中使用各種計算機輔助教學方式，它使課程內容更加生動有趣，能更好地激發政工干部的學習興趣；依靠網絡教學的方式還可以讓政工干部充分利用網上豐富的信息資源，相互交流學習；此外政工干部還可以合理安排自己的學習時間，選擇自己的學習方式，培養方式更加個性化。其次，政工干部利用信息的方式發生了改變。過去婦幼保健院的政工干部獲取信息主要靠閱讀各種紙質材料，現在政工干部閱讀的載體擴展到網絡信息，從文字擴展到圖像、聲音、三維等；在表達方式上實現了從直接手寫到鍵盤輸入、掃描等，包括直接復制或者刪減其他文件；在計算方式上也不再需要人工計算，利用計算機準確又迅速減輕了政工干部數據統計分析的負擔。
3.信息技術發展對政工干部素質培養帶來的問題
首先，信息鴻溝現象比較嚴重。在婦幼保健院的政工部門中，政工干部的能力有高有低，在掌握和使用現代信息技術方面也存在較大差異，這給政工干部的信息培養課程增加了不小的難度。其次，網絡信息量過于龐大。信息技術的發展使得，各種信息都能在網絡上迅速傳播，過量的信息會使人們很難找到自己所需要的信息，造成信息利用效率的下降，其中一些有害的信息更是嚴重影響政工干部的培養工作。
二、提高婦幼保健院政工干部培養質量的對策
1.定期完善政工干部培養方案
信息技術的發展變化是日新月異的，婦幼保健院要保證政工干部的培養緊跟時代的步伐就必須根據時代的變化對培養方案和教學計劃進行全面的調整和修訂，但是不能改變的是要始終強調培養信息化素質的重要性。培養方案的完善和修改可以從以下幾方面入手：教學目標、教學內容、教學課程專題、教師師資、教學材料和教學組織形式等，要突出強調信息化素質的地位。
2.精心設計培養的專題體系
婦幼保健院政工干部培養的基本平臺就是課程專題，怎樣設計合理的課程專題也成為政工干部培養工作的難題，可以明確的是必須要依據信息技術的發展對各類政工干部知識能力素質的客觀要求來建立課程專題體系，同時也要根據不同教學對象的性質、層次和類型做出調整。要根據政工干部的培養目標確定專題的類別和課時比例，各類專題都有圍繞解決新時期思想政治教育工作來設計，專題設置和內容都要做到內容精干、素材新穎、實在管用，不僅要包括信息化知識和技術的課程，還要有其他方面的課題。
3.打造政工干部培養的環境條件保障體系
婦幼保健院可以從以下幾個方面來支持政工部門的信息化工作。首先，配置完備的教學設施設備，包括計算機及網絡、多功能教室等。其次，建設多樣的信息化教學信息資源子系統，例如數字化圖書館信息資源、課程網絡信息資源、教學管理信息資源等。
總之，為了讓信息技術的發展更好地為婦幼保健院的政工干部培養工作服務，需要站在全局的高度將信息技術理論和方法應用到培養的全過程中，需要對政工干部培養的形式、內容、方法進行深刻變革，以提高政工干部培養的效率，全面提高政工干部信息化素質培養的質量和效益。
參考文獻：
[1]周軍、夏婷婷，論信息技術發展對政工干部培養影響及其對策，中國信息界，2012（05）
[2]梁晨，努力提高政工干部的信息素質，經濟研究導刊，2010（08）
干細胞培養技術范文第3篇
2010年諾貝爾生物醫學獎授予英國生理學家羅伯特•愛德華茲，以表彰他在“體外受精”技術領域做出的開創性貢獻。
1978年，羅伯特•愛德華教授和同事一起成功地使第一例試管嬰兒誕生，從此開創了生殖醫學領域的新紀元。試管嬰兒在20多年前也曾被世界輿論界視為洪水猛獸而大加抨擊，但時至今日，這項技術已經被全世界絕大多數國家承認，堪稱醫學史上的一大奇跡。迄今為止，全球已有上百萬試管嬰兒誕生。
被譽為“試管嬰兒之父”的英國劍橋大學教授羅伯特•愛德華說：“克隆單純從技術上講非常簡單，就是把卵細胞中DNA去掉，然后將體細胞中的DNA移入其中。這在世界上任何一個試管嬰兒實驗室中都可以完成，困難在于如何降低克隆的危險。”
本文以此熱點問題作為命題材料，對2011年高考生物試題進行單項預測。預測材料及其涉及的知識、試題如下：
1．試管嬰兒
【知識鏈接】要做好有關“試管嬰兒”的試題，除了書本上的知識外，還要掌握“試管嬰兒”技術的有關知識。“試管嬰兒”技術是通過將不孕夫婦的和卵細胞取出在試管中完全受精，并在試管中培養使其發育到囊胚期，再將胚胎移入女性子宮內使其發育成胎兒。
體外受精步驟包括：的采集與培養、卵母細胞的獲取與培養、體外受精等操作技術。具體過程如下圖:
哺乳動物胚胎發育的過程大體概括如下圖：
例1 下列關于關試管嬰兒的說法，不正確的是（）
A. 從良種母牛體內采集的卵母細胞都需要進行體外培養
B. 從良種公牛采集的需進行獲能處理
C. 早期胚胎移植的意義在于提高優良母畜的繁殖率
D. 早期胚胎指的是由受精卵發育至原腸胚時期的胚
解析：本題考查了試管嬰兒的相關知識。根據體外受精和胚胎發育過程圖解可知，早期胚胎指的是由受精卵發育至囊胚時的胚。
答案：D
例2 據2008年1月17日《干細胞》雜志報道，某科學家使用了進行試管受精的年輕女性捐獻的卵子，以及2名志愿者的皮膚成纖維細胞，成功克隆出了5個人體胚胎，進而可以開發出有研究價值的干細胞。請回答：
（1）上述過程中主要應用到的兩項動物細胞工程技術為；若將某經過修飾的基因導入其中的部分胚胎干細胞，常用的方法是。
（2）在使用合成培養基進行胚胎干細胞培養時，通常需要加入等天然成分；在細胞培養時，要保證被培養的細胞處于一定的氣體環境，所需要的氣體主要有 。
（3）科學家欲進行胚胎分割移植，則應該選擇發育良好、形態正常的或囊胚，將其移入盛有操作液的培養皿中，然后用分割針進行分割。
答案：（1）動物細胞培養、細胞核移植顯微注射技術（法）
（2）血清（血清、血漿） 氧氣和二氧化碳 （3）桑葚胚
2．克隆人研究
【知識鏈接】克隆人的基本原理是動物細胞核的全能性，包括胚胎細胞核移植和體細胞核移植。其基本過程為：
細胞核移植技術中注入去核卵母細胞中的不是供體細胞核，而是整個細胞，伴隨著兩細胞融合，體現細胞膜的結構特點：具有一定的流動性。該技術形成重組細胞繼而發育成一個新個體，體現了細胞核的全能性而非動物細胞的全能性。
例3 下圖為克隆人的示意圖，據圖回答：
（1）圖中所涉及的現代生物技術有、和
等。
（2）下列有關胚胎移植的敘述正確的有（）
A.沖卵指的是從子宮中沖出胚胎，而非沖出卵子
B.只有供、受體生理環境高度一致，移入受體的胚胎才能被接受，并繼續發育
C.供體和受體要進行免疫檢查，防止發生免疫排斥反應
D.不同動物其胚胎移植的時間不同，人的胚胎移植最好在四個細胞階段進行
（3）圖中兩個嬰兒長大后，外貌、性格和其他特征與原型男人相同，這說明 具有全能性。
（4）使用培養基進行胚胎干細胞培養時，通常要加入等天然成分，除了保證被培養細胞處于無菌、無毒及充足氧氣的環境中，還需要保證細胞生活所需的；早期胚胎發育在階段以前的細胞是全能細胞。
（5）圖中從“內細胞團到胚胎干細胞”的培養過程中，必須用處理內細胞團，使之分散成單個細胞。干細胞形成組織、器官必須要進行 和 。
（6）在體外培養胚胎干細胞能否獲得動物器官?
。為什么？
解析：（1）該圖利用了細胞核移植、動物細胞培養、胚胎分割移植等技術。（2）沖卵一般是指是胚胎收集中的沖卵――胚胎、早期胚胎。供體和受體只有保證具有相同的生理狀態，才能保證胚胎的正常發育。（3）克隆過程說明動物細胞核具有全能性。（4）動物細胞培養液的成分包括葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等。動物細胞培養的條件：無菌、無毒的環境；營養物質（合成培養基）；溫度和pH（36.5±0.5℃，7.2～7.4）；氣體環境（氧氣和二氧化碳）等。（5）動物細胞培養過程常用胰蛋白酶處理組織，以使之分散成單個細胞。（6）胚胎干細胞在體外培養條件下一般只能增殖進行細胞分裂，不能發生細胞分化。
答案：（1）核移植 胚胎移植 細胞培養（另外寫細胞融合、胚胎分割也對，寫了三個則給滿分）（2）ABD（3）動物體細胞核 （4）血清 溫度和pH 桑葚胚（5）胰蛋白酶 細胞的分裂 分化 （6）不能 胚胎干細胞在體外培養條件下可以增殖而不發生分化
3．生物技術中的倫理問題
【知識鏈接】生物技術引發的倫理問題包括克隆技術引發的倫理問題、試管嬰兒引發的倫理問題、基因檢測引發的倫理問題。中國政府對于克隆技術的態度是禁止生殖性克隆人，不反對治療性克隆人；對于試管嬰兒的態度，中國衛生部的規定是實施體外受精、胚胎移植及衍生技術必須獲得衛生部的批準證書。
例4下圖所示為人類“治療性克隆”的大致過程。請回答下列問題：
（1）圖中①為 細胞，過程A是目前實現體細胞克隆的關鍵技術，該技術稱為 。
（2）圖中③能誘導分化出神經細胞、血細胞、肌肉細胞，其根本原因是 的結果。這樣培育得到的組織器官進行自體移植的最大好處是 。
（3）若應用轉基因技術治療遺傳性糖尿病，可將健康人的控制胰島素合成的基因導入結構④中的
，原因是這些細胞 。
（4）在用PCR技術擴增胰島素基因時，緩沖溶液中必須加入的物質有：、分別與兩條模板鏈結合的兩種引物、 以及四種脫氧核苷酸。DNA的合成方向總是從子鏈的延伸。
（5）我國政府禁止生殖性克隆，但不反對治療性克隆研究。為什么要反對生殖性克隆（即克隆人）呢？請你寫出一條理由： 。
解析：從圖可以看才出，治療性克隆是將患者的體細胞的核與卵細胞的細胞質進行重組， 形成重組細胞，將重組細胞經過培養得到囊胚，取囊胚內細胞團培養得到不同組織器官，可用于進行自體移植，不會產生免疫排斥反應。
答案：（1）次級卵母（卵） 核移植
（2）基因選擇性表達不會產生排異（免疫排斥）反應
（3）內細胞團分化程度極低（或具有全能性），可使外源基因在相應組織細胞表達
干細胞培養技術范文第4篇
【摘要】 目的 探索大鼠骨髓源性肝干細胞同種異體移植后在受體大鼠模型肝內定居情況。方法 采用全骨髓培養法體外培養細胞，貼壁篩選純化骨髓間充質干細胞并進行體外培養、擴增，應用肝細胞生長因子(HGF)誘導分化出肝干細胞，鑒定后，經肝臟中葉注射入同種異體正常組和暴發性肝衰竭組大鼠體內，于移植后的第1、2、4周取受體肝臟移植原位（注射部位)、鄰位（距注射部位0.5 cm)組織，應用PCR技術檢測性別決定因子基因片段，研究肝干細胞在大鼠肝臟內定居情況。結果 經肝臟注射移植的肝干細胞在正常組和肝損傷組的肝臟內均能定居，且定居的細胞數量上肝損傷組明顯多于正常組。結論 經肝臟注射移植的骨髓源性肝干細胞可以定居于肝臟內，且定于肝臟的干細胞數量與肝臟是否損傷密切相關。
【關鍵詞】 骨髓間充質干細胞；肝干細胞；細胞移植
骨髓間充質干細胞(MSCs) 具有多向分化潛能，可以在體外誘導分化出肝干細胞，此種骨髓源性肝干細胞可以為肝組織移植工程提供新的細胞來源。近年來的研究主要集中于體外誘導MSCs為肝干細胞，此種細胞具備了肝細胞的形態，在體外能夠表現出一定的肝細胞功能〔1〕，但對骨髓源性肝干細胞在體內的定居和定位能力情況尚不明確。本實驗通過對大鼠MSCs進行體外培養，誘導、分化出肝干細胞，同時建立暴發性大鼠肝衰竭模型，探討骨髓源性肝干細胞同種異體移植后在受體大鼠模型肝內定居情況。
1 材料與方法
1.1 材料
低糖DMEM培養基(Invitrogen)、Percoll(Pharmacia，比重1.077 g/L)(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青)、胰蛋白酶2(Sigma)、肝細胞生長因子（HGF)(CYTOALAB公司)、細胞培養箱(Forma公司)；純系SD大鼠、3周齡、體重100～120 g(供體大鼠)和成年純系SD雌性大鼠、體重180～220 g(受體大鼠)，由吉林大學實驗動物中心提供。
1.2 骨髓源性肝干細胞培養
1.2.1 MSCs分離、培養及定向肝干細胞的誘導分化
從供體SD大鼠股骨提取骨髓細胞。用比重1.073的Percoll分離液行MSCs分離，加含抗生素及10%小牛血清的IMDM培養和擴增，取第3代MSCs加入HGF(20 μg/L)誘導定向肝干細胞分化。
1.2.2 誘導后的骨髓源性肝干細胞鑒定
用ELASA法檢測細胞培養液中的甲胎蛋白（AFP)、白蛋白（ALB)。用免疫組化法檢測細胞中細胞角化蛋白（CK)18、CK19和波形蛋白（Vimentin)的表達。
1.3 肝損傷動物模型的制作和分組
受體雌性SD大鼠20只，隨機分為正常大鼠組和肝損傷組。肝損傷組用質量濃度10%D氨基半乳糖溶液一次腹腔內注射，劑量1 200 mg/kg體重。
1.4 同種異體大鼠骨髓源性肝干細胞移植
正常組大鼠和肝損傷組大鼠，分別以戊巴比妥麻醉，仰臥位固定，常規消毒、備皮、鋪無菌巾，上腹正中切口，長約1 cm，于肝中葉以BD胰島素注射器注射肝干細胞懸液0.4 ml（107/ml )，觀察無出血后縫合傷口。
1.5 受體體內移植骨髓源性肝干細胞鑒定
應用PCR技術檢測性別決定因子基因片段(sex determining region of the Y，Sry)。干細胞移植后1，2，4 w后取受體肝臟移植原位(注射部位)、鄰位(距注射部位0.5 cm)組織，應用PCR技術檢測〔2〕性別決定因子基因片段(Sry)。引物按文獻〔3〕設計，由上海Casarry生物有限公司合成序列，外引物對SRY1/ SRY2擴增片段大小為317 bp，內引物對SRY3/SRY4擴增片段大小為121 bp。
2 結 果
2.1 骨髓源性肝干細胞的培養結果 大鼠MSCs經原代培養，細胞傳代，誘導分化，細胞異形性較誘導前增加，表現為圓形、橢圓形細胞數量較誘導前明顯增加，而梭形細胞數量減少，誘導培養10 d左右，細胞形態表現為圓形、橢圓形細胞為主，梭形細胞已極少見。免疫組化染色，二氨基聯苯胺（DAB)顯色，在倒置顯微鏡下，可見細胞形狀顯圓形或卵圓形，胞漿內出現棕黃色顆粒。CK18、CK19、Vimentin呈陽性表達。細胞培養液中AFP、ALB含量誘導前分別為(0.021±0.008) ng/ml和(0.72±0.14) g/L；誘導后分別為(0.403±0.042) ng/ml，(6.1±0.32) g/L。誘導后的AFP、ALB含量明顯高于誘導前（P＜0.05)。表明經誘導的MSCs分化為肝干細胞。見圖1。
2.2 肝損傷模型病理結果
D氨基半乳糖注射后，大鼠肝臟肝索紊亂，肝細胞腫脹變性、灶性及大片壞死，伴出血及炎性細胞浸潤。見圖2。
2.3 性別決定因子基因片段檢測結果
肝損傷組：檢測1 w時陰性，2 w時原位肝組織Sry陽性表達，鄰位未表達，而4 w時原位及鄰位組織檢測到Sry表達，原位表達較2 w時增強，鄰位較弱。正常肝臟組：1及2 w均未檢測到表達，4 w時檢測到原位微弱表達。見圖3。
3 討 論
MSCs具有多向分化潛能，特別是具有向肝臟干細胞、肝細胞及血管內皮細胞分化的潛能〔4〕，因而有望成為肝組織移植工程新的種子細胞來源。由于MSCs是成體干細胞，取材方便，可以來自患者自身，無排斥反應，故具有重要的臨床應用價值。本實驗根據文獻報道〔5〕，使用HGF，使MSCs分化為肝干細胞，對骨髓源性肝干細胞同種異體移植后在受體大鼠模型肝內定居情況進行初步研究。
目前研究表明移植肝干細胞可存活于受體許多部位包括肝、脾、腹腔、胰腺、肺、腸系膜、腎及腎脂肪囊、腹膜后等部位〔2，6～8〕。肝臟由于其獨特的營養環境、生理及解剖結構環境無疑是最理想的場所，可經門靜脈輸入或肝實質植入，該組實驗采用肝臟植入方法，取得較好效果，說明此方法是安全可行的。本實驗采用同種異體移植，應該考慮免疫排斥反應，但文獻報道，純化的MSCs具有獨特的免疫原性，進行同種異體移植不需要預先應用免疫抑制劑，無免疫排斥反應，是良好的基因治療靶細胞。
目前鑒定受體體內被移植后的肝干細胞有許多方法，其中較為常用的是以雄性動物為肝干細胞供體〔1〕，雌性動物接受細胞移植后，分化增殖的細胞 Y 染色體陽性，證明雌性受體內存活的細胞來自雄性供體細胞，這就可以清楚地將植入的細胞與原有的細胞區分開來，進一步研究移植作用，本實驗采用雄性供體細胞為雌性受體移植，檢測移植部位細胞的Y染色體表達情況，進而檢測移植細胞是否定植。
實驗結果顯示，移植后2 w肝衰竭大鼠移植原位檢測到表達，4 w表達明顯增強，而且臨近部位出現表達；正常大鼠在移植后4 w移植原位出現微弱表達。實驗證實，骨髓源性肝干細胞在正常大鼠肝臟及肝損傷大鼠肝臟內均能定居，但在肝損傷大鼠肝臟內定居能力明顯增強。考慮可能為大鼠肝損傷后，刺激機體分泌出各種促進肝細胞再生的生長因子，為移植細胞提供定居所需的微環境。文獻報道，在正常大鼠體內，HGF等因子的活性是被抑制的，只有在肝損傷時，啟動肝再生程序，這些因子才能被激活，引起肝細胞有絲分裂。
本文通過實驗證實了大鼠骨髓源性肝干細胞移植后可以定居于受體肝臟內，而且在肝損傷后有利于干細胞移植的定居，這為下一步研究定居于肝內的骨髓源性肝干細胞的功能奠定了基礎。
參考文獻
1 李秉璐，曲 強，趙玉沛，等.人骨髓基質干細胞向肝細胞分化過程中白蛋白的表達研究〔J〕.中華外科雜志，2005；43（11)：7135.
2 高英堂，馬夢蘭，劉 敏.人類Sry基因用于產前診斷的初步研究〔J〕.中華婦產科雜志，1997；32（11)：6524.
3 Tashiro H，Fukuda Y，Kimura A，et al.Assessment of microchimerism in rat liver transplantation by polymerase chain reaction〔J〕.Hepatology，1996；23（4):82834.
4 Schwartz RE，Reyes M，Koodie L，et al.Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocytelike cells〔J〕.J Clin Invest，2002；109（10):1291302.
5 張剛慶，方馳華，池達智.肝細胞生長因子誘導骨髓間充質干細胞向肝細胞分化的實驗研究〔J〕.中華外科雜志，2005；43（11)：71620.
6 Fox IJ，Chowdhury JR.Hepatocyte transplantation〔J〕.Am J Transplant，2004；6:713.
干細胞培養技術范文第5篇
[關鍵詞]表皮干細胞；酶消化法；組織工程皮膚；分離；培養
[中圖分類號]R318 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2011）01-0079-04
Improved culture method of Human epidermal stem cell and tissue engineering skin construction
ZHANG Yan-gang, HU Da-hai, ZHANG Zhan-feng,CAI Wei-xia, ZHU Hua-yu, SHE Tao
(Department of Burn and Skin Surgery, Burns Center of PLA, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi'an 701132,Shaanxi,China)
Abstract:ObjectiveTo improve the traditional methods of dissociation and culture of the human epidermal stem cells (hESCs) and provide more productive and more active seed cells for tissue engineering skin construction.MethodsCell morphology was observed by inverted microscope, MTT law growth curve. Immunocytochemistry was used to observe the expression of β1 integrin and keratin 19 (CK19) on epidermal stem cells. Compare the morphological features of tissue engineered skin constructed with the seed cells which were obtained by two methods.Results Trypan blue staining displays the number of hESCs dissociated by modified method is(92.25±15.61)significantly elevated compared with traditional method (68.50±26.91)(P＜0.01),and the proportion of living cells 94%±0.01% increased significantly compared with traditional method(75%±0.04%)(P＜0.05).The result of immunocytochemistry showed that the expression of β1 integrin and keratin 19(CK19) was positive, which were markers of hESCs. HE staining showed that, by using the improved method, the number of multiple epidermal layers was 5～6 on tissue engineering, and cells of epidermal in the basal partwere arranged. In contrast, the number of multiple epidermal layers was 3～4, and the cells of epidermal in basal part arranged in scattered by using the traditional method. ConclusionHuman epidermal stem cells in a larger amount and better vitality can be obtained by using a modified enzyme digestion method, which form basis of construction of skin tissue engineering.
Key words:human epidermal stem cells; enzyme digestion; tissue engineering skin; dissociating; culturing
近年來仿照皮膚的生理結構，人們構建各種組織工程皮膚，有望解決皮源短缺及預后瘢痕的問題，其種子細胞主要是表皮干細胞、成纖維細胞等。因此，表皮干細胞的分離、培養就成了必須面對的問題，在以往的報道中[1-4]，有關hESCs的培養常采用中性蛋白酶（Dispase）消化過夜分離表皮層、再以0.25%胰蛋白酶37℃消化10～15 min分離表皮干細胞，但實際應用中發現該方法存在細胞活力差，產率低等缺點。本研究中我們采用改良后的方法分離培養hESCs并和常規的培養方法加以比較，旨在建立一種更為高效的分離培養表皮干細胞的方法。
1材料和方法
1.1 實驗材料和主要儀器：取小兒包皮組織（2～6歲），(來自西京醫院泌尿外科包皮環切術，均取得患者家屬知情同意)。DispaseⅡ酶（Gibco）；Trypsin（Gibco）；DMEM (Hyclone)；胎牛血清（FBS，杭州四季青）；角質形成細胞無血清培養基(K-SFM，Gibco)；表皮生長因子（epidemal growth factor, EGF）和牛垂體提取物（bovine pituitary extract, BPE）(Gibco)；人胎盤Ⅳ型膠原(Sigma)，MTT (Gibco)；DMSO (西安化學試劑廠)；多聚甲醛(西安化學試劑廠)；小鼠抗人β1整合素（鼠單抗IgG）、CK19（鼠單抗IgG） (北京中杉金橋生物技術公司）；鼠尾膠原（自制）；臺盼藍；倒置熒光顯微鏡（Olympus）；M680型酶標儀（伯樂公司）。
1.2人表皮干細胞分離、培養：修剪皮下結締組織，0.9% NaCl浸泡、清洗3遍，每次5～10min，0.05%醋酸氯已定+0.9% NaCl（1:2，體積比）浸泡5～8min，再次0.9% NaCl浸泡清洗3遍，每次10min，然后將上述組織塊置于4℃ Dispase酶(0.25%)浸泡14～16h。以下為兩種方法分離人表皮干細胞。
傳統方法：取出皮片，0.9% NaCl反復清洗，分離表皮和真皮層，剪碎表皮為1.0mm×1.0mm，加0.25% Trypsin + 0.02% EDTA，37 ℃水浴10min加入含有10% FBS的DEME終止消化。反復吹吸至細胞懸浮，200目篩網過濾，1 000rpm離心5～10min，棄上清，收集細胞，用人表皮干細胞培養基重新懸浮細胞（10ml），吹打成單細胞懸液，臺盼藍染色。并接種于預先鋪有Ⅳ型膠原的25cm2培養瓶內，置于37℃，5% CO2孵育箱中孵育10～15 min后，吸出培養液及未貼壁細胞，PBS洗2次，加入適量新鮮培養基（K-SFM，5ng/ml hEGF，30 μg/ml BPE）繼續培養。
改良方法：取出皮片，0.9%氯化鈉反復清洗，分離表皮和真皮層，將表皮置于小抗生素瓶后加0.125% Trypsin+ 0.01% EDTA3ml，彎頭吸管快速攪拌2min，吸出并加入離心管（已經加有10% FBS的DMEM 1.5ml）中和，再次重復消化一次，吸出后加入另一離心管（已經加有10% FBS的DMEM 1.5ml）中和，將前后兩次消化液體合并，離心（1 000rpm，5min），PBS10ml懸浮細胞，臺盼藍染色鑒定后，再次離心（1000rpm，5min），表皮干細胞培養基（K-SFM）懸浮細胞，接種于預先鋪有Ⅳ型膠原的培養瓶內，置于37℃，5% CO2孵育箱中孵育4～5min后，吸出培養液及未貼壁細胞，PBS洗2次,加入適量新鮮表皮細胞培養基培養（K-SFM，5ng/ml hEGF, 30μg/ml BPE）。
1.3表皮干細胞增殖：將兩種方法分離出的hESCs分別作MTT比色試驗。兩組細胞均以1×105個/孔的密度接種預先鋪有Ⅳ型膠原的24孔板內，每24h取3孔做MTT比色實驗。根據每天記錄的細胞數繪制細胞生長曲線圖。
1.4 表皮干細胞鑒定：取二代表皮干細胞培養36 h，PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗；0.1%Triton X-100孵育10min；PBS清洗3次，每次5min；3%H2O2去離子水孵育5～10min，以消除內源性過氧化物酶活性；2%山羊血清封閉20 min,加入CK19（1:50稀釋）、整合素-β1（1:50稀釋）一抗4 ℃過夜；PBS洗5次，滴加生物素化二抗工作液200μl，37℃孵育10min，PBS洗5次；滴加辣根酶標記鏈霉素卵白素工作液200μl, 37℃孵育10min，PBS洗5次；顯色劑顯色。
1.5構建組織工程皮膚：以兩種不同方法分離、培養的hESCs為種子細胞，鼠尾膠原復合成纖維細胞作為支架材料構建組織工程皮膚。4ml 5×DMEM和14ml膠原于冰上混勻，用1mol/L NaOH調至中性后，加入2mlFBS（含2×106成纖維細胞）混勻，以3ml/孔加入Transwell小室內，放入37℃，5% CO2孵箱培育，待其凝固后加入10% FBS的DMEM，繼續培養，24h后將2代hESCs以3×106/孔種植于鼠尾膠原表面，氣-液面培養1周。
1.6 統計學分析：采用SPSS11.0軟件進行統計處理，實驗數據以x±s表示，兩組間均數比較行兩樣本t的方差分析， P＜0.05為差異有顯著性意義。
2結果
2.1 改良消化法和傳統消化法細胞消化效率的比較：將同一塊包皮組織等份分開，用兩種方法同時分離表皮細胞，臺盼藍染色、細胞計數（總體積均為10ml），實驗獨立重復5次。
2.2改良法和傳統法分離細胞形態學比較：采用Ⅳ型膠原粘附法分選表皮干細胞，改良法較傳統法粘附細胞密度大，4h后大部分細胞貼壁良好，鏡下可見細胞胞體小，核質比大，呈三角形或多邊形。接種后第二天培養基中存在一定數量的漂浮細胞，但改良法漂浮細胞數明顯少（圖2）。3天后，有部分細胞形成較小克隆，胞體緊密相靠，胞膜互相銜接，呈典型“鋪路石樣”生長。
2.3改良法和傳統法細胞增殖比較：兩組細胞在第2天細胞數量有所下降，均在第4天時進入對數生長期，改良法細胞在對數期呈明顯上升趨勢，于第7天到達平臺期，鏡下觀察細胞融合；傳統法細胞對數期上升緩慢，第8天時細胞仍未融合。由此表明出改良法細胞活性較好生長較快（圖3）。
2.4改良法和傳統法分離細胞的鑒定天對采用兩種方法培養的hESCs行K19、β1整合素免疫染色，結果顯示，95%以上細胞K19、β1整合素均呈陽性表達(圖4)，且兩種方獲得的表皮干細胞生物學特性無顯著差異。
2.5 改良法和傳統法分離的細胞構建組織工程皮膚組織學比較：兩種方法分離培養的hESCs分別構建出的組織工程皮膚均呈3層：由下到上為真皮層、表皮層、角質層。改良法細胞構建的組織工程皮膚表皮層厚，約5～6層，表皮和真皮交接處可見細胞排列整齊，形似基底細胞。傳統法細胞構建的組織工程皮膚表皮層較薄，約3～4層，表皮真皮交接處未見類似基底細胞（圖5）。
3 討論
hESCs是皮膚組織的特異性干細胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能。是皮膚發生、修復、重塑的關鍵性源泉[5]，以其作為種子細胞構建組織工程皮膚，可獲得與生理皮膚相類似的組織結構。臨床上大面積較深度燒傷往往導致表皮、真皮的損傷缺失，近年來，利用含有hESCs的組織工程皮膚覆蓋創面取得一定的效果，而在其構建的過程中表皮干細胞的分離培養是必須面對的問題。
傳統的方法中表皮層與真皮層分離后，用剪刀剪碎成1.0mm×1.0mm大小后進行胰蛋白酶消化，減碎的過程中暴露在組織邊緣的細胞增多，而剪刀的擠壓可對組織造成擠壓損傷[6]，導致部分細胞壁損害進而細胞活力下降或死亡，在改良的方法中，直接進行胰酶消化避免了這一損傷情況的發生。在胰酶消化這一步，傳統方法采用0.25%胰蛋白酶＋0.02% EDTA，37℃水浴，10min，而改良方法以0.125%＋0.01% EDTA胰蛋白酶也可以消化下來表皮干細胞，并且胰蛋白酶的含量低，減少了胰蛋白酶對細胞的損傷。當胰酶將細胞分泌的粘蛋白膜水解后，如還沒有終止它的活性，此時胰酶就有可能進攻細胞內的某些蛋白質，造成它們的解離，進而誘發細胞凋亡[7]。胰酶濃度的降低也少了中和血清的用量，從而降低了血清對hESCs分化的影響[8]。對比傳統方法，將37℃消化改為常溫下消化，進一步降低胰酶的活性。為了進一步減少胰酶對細胞的損傷，再將傳統方法的消化10min改良為2次消化，每次2min總計4min，每次消化后立即終止。以往的方法中，用來消化時，將剪碎的細胞置于胰酶中反復吹打，而吹打本身也會造成細胞損傷，且吹打容易產生泡沫加劇細胞損害，本改良方法中，只以吸管做攪動，充分均勻胰酶的消化作用又不會產生吹吸的作用，減少了細胞在反復吹打過程中的損傷。
將同一塊包皮組織等份分開，用兩種方法同時分離hESCs，臺盼藍染色結果表明：改良法的活細胞率明顯大于傳統法細胞，從形態上觀察，細胞展開生長無差異。我們用兩種方法培養的原代細胞繪制細胞生長曲線（圖3），可以看出改良法細胞存活數量多，增殖速度快，細胞活性好，證明了改良法培養可以快速獲得大量hESCs。研究表明，K19表達陽性的細胞多分布在毛囊隆突部和基底膜，且具有干細胞的慢周期性和強大的增殖特性，而終末分化的表皮細胞則表達K10。所以K19也被認為是表皮干細胞的特異性標志[9]。β1整合素不僅介導表皮干細胞與細胞外基質的黏附，也調控終末分化啟動，β1整合素表達的降低會刺激表皮干細胞離開干細胞池，向上遷移成為終末分化細胞，因而認為β1整合素高表達可以是表皮干細胞的標志物之一[10-11]。我們將應用Ⅳ膠原快速貼壁的改良法細胞通過細胞免疫化學方法研究，顯示改良法細胞K19、β1整合素呈陽性表達，證實了采用改良方法培養的細胞為hESCs。進一步分別采用兩組細胞為種子細胞，鼠尾膠原為支架構建組織工程皮膚，組織切片HE染色顯示改良組hESCs細胞構建的組織工程皮膚表皮層較厚，細胞復層多，表皮細胞復層層數為5～6層、基底細胞排列整齊，而傳統組hESCs構建的組織工程皮膚表皮細胞復層層數為3-4層、基底細胞排列散亂，表明應用改良組細胞更適宜構建組織工程皮膚（圖5）。
表皮干細胞是一種在成年期還能維持較高的自我更新能力的細胞群，在正常狀態下維持表皮的自我更新，當受到損傷刺激時，表皮干細胞可以參與皮膚損傷的修復[12]，本研究采用改良法分離培hESCs并與傳統方法對比，顯示出改良方法培養出的hESCs活力和增值能力更好，構建的組織工程皮膚具有更好的形態結構，為以表皮干細胞為種子細胞構建組織工程皮膚進一步奠定了基礎。
[參考文獻]
[1]謝曉繁,賈赤宇,付小兵,等.成體表皮干細胞的分離培養與鑒定[J].中國危重病急救醫學, 2006,18(1):46-48.
[2]李富,付小兵,劉文忠.人表皮干細胞分離培養和純化鑒定的進展[J].感染、炎癥、修復,2008,9(4):240-242.
[3]謝舉臨,利天增,祈少海,等.體外培養表皮干細胞構建組織工程皮膚的研究[J].中華實驗外科雜志,2006,23(12):1533-1535.
[4]楊斌,洪清琦,徐令,等.表皮干細胞的快速高效分離[J].組織工程與重建外科雜志,2005,1(5):268-271.
[5]Cotsarelis G, Kaur P, Dhouailly D, et al. Epithelial stem cell in the skin: definition, markers, localization and functions[J]. Exp Dermatol,1999, 8(1):80-88.
[6]司徒鎮強,吳軍正. 細胞培養[M].西安:世界圖書出版社,2004:66-67.
[7]Reddy NM, Lange CS. Serum, trypsin, and cell shape but not cell-to-cell contact influence the X-ray sensitivity of Chinese hamster V79 cells in monolayers and in spheroids[J]. Radiat Res,1991,127(1):30-35.
[8]李丹,李世榮,曹川.人表皮干細胞的體外分離培養和鑒定[J].中國美容醫學,2007,16(10):1343-1346.
[9]LI J,Miao C,Guo W,et al. Enrichment of putative human epidermal stem cells based on cell size and collagen type IV adhesiveness[J]. Cell Res,2008,18(3): 360-371.
[10]Liu Y,Zhou H, Gao F. Isolation and identification of stem cells fromcashmere goat skin [J]. Int J Dermatol,2008,47(6): 551-556.
[11]Zhu JW,Lai XN,Wang ZG, et al. Effect of substance P on the migration and differentiation of cultured epidermal stem cells to hair follicle in vitro [J]. Zhonghua Shaoshang Zazhi,2007,23(3): 204-207.
