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摘要：【目的】觀察補腎生精法對老齡大鼠睪丸蛋白表達譜的影響?！痉椒ā窟x用20只22月齡老齡雄性SD大鼠隨機分為2組，每組10只，分別為空白對照組和補腎生精組；補腎生精組給藥劑量為0.05g·kg-1·d-1，連續灌胃給藥60d。取大鼠右側睪丸，采用雙向凝膠電泳法分析空白對照組和補腎生精組大鼠睪丸差異表達蛋白?！窘Y果】與空白對照組比較，補腎生精組大鼠睪丸中有7種蛋白表達發生了顯著變化，其中4種蛋白表達上調，3種下調。對7種差異表達蛋白點膠內酶切后進行質譜分析，其中5種蛋白分別鑒定為磷脂酰乙醇胺結合蛋白（phosphatidylethanolaminebindingprotein,PEBP）、熱休克蛋白8(heatshock70kDaprotein8，HSP7C)、磷酸丙糖異構酶(triosephosphateisomerase，TPIS)、3磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde3phosphatedehydrogenase，GAPDH）、谷胱苷肽S基轉移酶1（glutathioneStransferaseMu1，GSTM11）。【結論】補腎生精法延緩衰老的作用可能與其能調節老齡大鼠睪丸蛋白表達有關。

關鍵詞：補腎生精法/治療應用；衰老/中藥療法；蛋白質組；疾病模型，動物；大鼠

睪丸功能的減退與男性衰老之間存在著重要的聯系。近來多項研究表明，從50歲開始，隨著年齡的增長，男性由于睪丸雄激素合成功能逐步衰退而引起一系列的臨床綜合征稱為中老年男性部分雄性激素缺乏綜合征（PADAM）［1］。中醫學認為腎虛是衰老的主要原因，現代研究也證明腎虛與衰老密切相關，補腎方藥確有延緩衰老作用［2-3］。為了探討補腎生精方藥延緩衰老的機理，我們應用蛋白質組學技術，觀察了補腎生精顆粒對老齡大鼠睪丸蛋白表達譜的影響?，F報道如下。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器固相pH梯度(immobilinepHgradient,IPG)膠條、尿素、硫脲、二硫蘇糖醇(DTT)、甘油、蛋白質相對分子量標記、3［3（膽酰胺丙基）二甲氨基］丙磺酸內鹽（CHAPS）、膠條緩沖液(IPGbuffer)、凝膠條覆蓋液、膠槽清洗液、過硫酸胺(APS),十二烷基磺酸鈉(SDS）均購自Amershambiotech公司;復合蛋白酶抑制劑(proteaseinhibitorcocktail）購自Pierce公司；碘乙酞胺、體積分數37%甲醛溶液、三氟乙酸（FA)、乙腈(ACN)均購自Sigma公司;胰蛋白酶購自Promega公司；低熔點瓊脂糖、硫代硫酸鈉、牛血清白蛋白(BSA)均購自上海生工公司;乙酸、無水乙醇、甲醇、硝酸銀、無水碳酸鈉、乙二胺四乙酸鈉(EDTANa+)、考馬氏亮藍R250、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸均為國產分析純。等電聚焦系統（IPGphor）、GS800凝膠成像儀、ImageMaster2Dplatinumsoftware5.0軟件均由美國BIORAD提供；基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（MALDITOF，AMERICAAPPLYSYSTEM）。

1.2藥物制備補腎生精顆粒主要由菟絲子、枸杞子、淫羊藿等組成，由廣東省中醫院制劑室提供（批號：06071802）。配成濃度為50mg/L混懸液，滅菌后4℃保存備用。

1.3動物及分組選用22月齡老年雄性SD大鼠20只（購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，合格證號：醫動字06493），隨機分為2組，每組各10只，分別為空白對照組（灌喂等容積生理鹽水）和補腎生精組（給藥劑量為0.05g·kg-1·d-1），連續給藥2個月。

1.4蛋白抽提與定量以30g/L戊巴比妥20mg/kg腹腔注射麻醉動物；取大鼠右側睪丸，剝去白膜，迅速置于液氮中，研碎；加入適量蛋白抽提試劑［8mol/L尿素、0.2g/LCHAPS、20mmol/LDTT、1mmol/LEDTA，1mmol/L苯甲基磺酸氟（PMSF）以及蛋白酶抑制劑混合物］；震蕩溶解后，室溫孵育1h，離心(4℃、12000g)15min，取上清，分裝保存于-70℃冰箱；蛋白定量采用Bradford法。

1.5雙向電泳選取pH值為3～10的線性IPG膠條，采用IPGphorSystem進行第一向等電聚焦。取1mg蛋白，溶于重泡脹液(8mol/L尿素、0.2g/LCHAPS、0.02mol/LDTT、0.5g/LIPG緩沖液)；將聚焦后的膠條在SDS平衡液(6mol/L尿素，20g/LSDS，1.5mol/LTrisHCl、pH8.8，體積分數30%甘油)中平衡2次(搖床上振蕩)，每次15min。其中，第1次平衡液中加入20mmol/LDTT，第2次平衡液中加入100mmol/L碘乙酰胺；取出膠條在PROTENIIxiCell上進行垂直方向的第二向電泳，即SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒流40mA，40min；置固定液(乙醇和乙酸的混合水溶液，含體積分數40%乙醇、10%乙酸)中固定30min；用1g/L考馬斯亮藍染液R250進行凝膠染色3h，脫色過夜。

1.6圖像分析采用凝膠成像儀掃描成二值圖像格式（TIFF格式）圖像(分辨率為300dpi)，然后用ImageMaster2Dplatinumsoftware5.0軟件進行差異分析。

1.7酶切和質譜分析觀察差異蛋白點在凝膠上的原始位置，切下滿足下面兩個條件的蛋白點進行質譜分析：(1)在4次重復膠上均能找到，且差異顯著；(2)無明顯拖尾、變形，且完全分離。將蛋白膠粒均勻切碎，置1.5mL離心管中，用去離子水清洗2次，加入脫色液(體積分數50%乙腈、25mmol/L碳酸氫銨)100μL，搖床振蕩20min，棄去溶液，重復2次，直至膠片中的藍色脫盡，真空離心干燥；加入適量胰酶液(0.01μg/μL，含25mmol/L碳酸氫銨，5mmol/L氯化鈣)，置于4℃冰箱泡脹20～30min，酶液被完全吸收后，補充5～10μL酶解緩沖液，37℃過夜(約16h);離心，吸取1μL酶解液，與飽和基質溶液α氰基4羥基肉桂酸（αCCA）充分混勻后點靶，進行質譜分析。

1.8生物信息學分析登陸NCBI網站對質譜分析鑒定的差異表達蛋白進行結構域分析。2結果

2.1老齡大鼠睪丸蛋白表達譜的變化提取睪丸蛋白，對空白對照組和補腎生精組大鼠的睪丸蛋白一起進行雙向電泳，其代表性考馬斯亮藍染色電泳圖譜見圖1。ImageMaster2Dplatinumsoftware5.0軟件分析結果表明，平均每塊凝膠上可找到600個左右蛋白點。選取空白對照組中一塊凝膠作參照，其蛋白點匹配率為89%，補腎生精組蛋白點匹配率為87%，保證了良好的重復性。

2.2差異蛋白點的質譜分析選取并切下滿足條件的蛋白點(補腎生精組與空白對照組之間表達水平上調5倍以上和下調0.2倍以下的蛋白點)，共分析了7個差異表達蛋白點，其中4個蛋白點在補腎生精組表達高于空白對照組，其他3個點相反。膠內酶切后，進行質譜鑒定及查庫分析。其中5種蛋白分別鑒定為磷脂酰乙醇胺結合蛋白（phosphatidylethanolaminebindingprotein,PEBP）、熱休克蛋白8(heatshock70kDaprotein8，HSP7C)、磷酸丙糖異構酶(triosephosphateisomerase，TPIS)、3磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde3phosphatedehydrogenase，GAPDH）、谷胱苷肽S基轉移酶1（glutathioneStransferaseMu1，GSTM11）。其中，在補腎生精組中HSP7C和GSTM11蛋白表達下調，而PEBP、TPIS和GAPDH蛋白表達上調。該5種蛋白的酶切產物質譜分析色譜圖見圖2。

3討論

中醫學認為腎主生殖。有研究表明［2］，機體老化是一種生理性腎陽虛，腎陽虛是未老先衰的一種表現。睪丸功能的減退與男性衰老之間存在著重要的聯系。腎陽虛證具有下丘腦-垂體-性腺軸（HPG）功能紊亂，補腎中藥能明顯提高男性老年人血清睪酮水平，能改善老年大鼠睪丸間質細胞曲細精管的結構。

補腎生精顆粒主要由菟絲子、枸杞子、淫羊藿等組成，具有補腎生精之功效。我們臨床用于治療男性更年期綜合征、男性不育癥、少弱精子癥等病均具有較好療效。現代藥理研究證明［4］，方中淫羊藿辛溫，入肝、腎經，補腎助陽，含鋅、錳水平較高，具有雄性激素樣作用，`能興奮性機能，使精液分泌亢進，為精子獲能創造良好的內環境。菟絲子主要補養肝腎、益精，能促進性腺及附屬性腺發育，提高精子質量，對過氧化損傷（ROS）造成的精子膜、頂體結構和精子線粒體功能損傷具有明顯的干預作用。

本實驗共分析了7個差異表達蛋白點，其中4個蛋白點在補腎生精組表達高于空白對照組，其他3個點相反，且HSP7C和GSTM11蛋白在補腎益精組中表達下調，而PEBP、TPIS和GAPDH蛋白表達上調。PEBP又稱為Raf激酶抑制蛋白（RKIP)，是Raf/MAPK信號通路的調節子和轉移性腫瘤(metastaticcancer)抑制劑［5］，PEBP可能與生精過程中生殖細胞分裂活動有關。熱休克蛋白基因hsp702、hsc70t是生精細胞特異表達基因［6］，其中hsc70t在減數分裂后表達，hsp702敲除雄性大鼠的精子產生被阻斷在第一次減數分裂，導致不育，而雌性大鼠正常。免疫共沉淀和體外結合實驗顯示hsp702在大鼠睪丸中直接與周期蛋白依賴性蛋白激酶1(CDK1)作用，表明它可能作為分子伴侶參與CDK1和細胞周期蛋白cyclinB1形成M期促進因子(MPF)復合物。GSTM11是二聚體蛋白［7］，除在肝臟大量表達外，還存在于睪丸組織，催化還原性谷胱苷肽與化學物質販親電子基團結合，對精子的抗氧化損傷具有保護作用。TPIS是糖酵解途徑的關鍵酶，附睪精子糖酵解活動受到抑制則能產生抗生育作用。精子尾巴的運動產生了精子的運動力，但這種運動需要ATP提供足夠的能量［8］。一般認為，細胞中的線粒體能夠提供精子運動所需的ATP。精子運動力和ATP的制造主要依賴于糖酵解過程，GAPDH能夠緊密地結合到精子尾巴的特定結構區域上。利用基因靶向或稱基因敲除技術制造出缺失這種酶的小鼠，因為缺少GAPDH，小鼠精子中的糖酵解就被有選擇地抑制并因此無法產生ATP，雌性小鼠表現正常，而雄性小鼠具有正常的睪丸和精蟲數卻無法授精。顯微鏡觀察結果表明缺少GAPDH的精子缺乏運動力。糖酵解并不能像線粒體那樣高效地制造出能量，但是這個途徑中的GAPDH酶卻對精子的運動非常重要［9］。因此，這項研究證明GAPDH可能是避孕藥劑的一個有效的靶標。

本研究通過觀察補腎生精法對衰老過程睪丸蛋白表達的影響，有助于從蛋白質組水平闡釋中醫腎主生殖以及補腎中藥延緩睪丸衰老的本質。

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