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1重組載體的測序結(jié)果

將重組載體pMAL－c2x／SAP2送至公司測序，測序結(jié)果與GenBank中白球絲標(biāo)準(zhǔn)株SC5314的SAP2基因序列進(jìn)行同源性對比，發(fā)現(xiàn)1處發(fā)生堿基置換，即468位A→T，但編碼的氨基酸相同，且SAP2基因插入的方向正確，保證了氨基酸序列的編碼正確性，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2重組載體pMAL－c2x／SAP2的可溶性表達(dá)

轉(zhuǎn)入E．coliBL21（DE3）的pMAL－c2x／SAP2在16℃下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)14h表達(dá)出目的蛋白，通過SDS－PAGE電泳分析目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在，表達(dá)量約占總蛋白的10％，沉淀占總表達(dá)量的10％。目的蛋白純化將誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白超聲破碎后，用淀粉樹脂對其親和層析純化及蛋白酶切后，結(jié)果顯示，41kD處有一明顯條帶，蛋白純度＞90％。。抗血清的效價檢測通過間接ELISA法檢測抗體，其滴度值見，滴度曲線見。效價達(dá)到抗血清的純化將抗血清進(jìn)行ProteinG親和層析純化后行SDS－PAGE電泳檢測，25kD和55kD處可見2條清晰的條帶，即抗體的輕鏈和重鏈，無雜蛋白帶出現(xiàn)。純化后的抗體經(jīng)BCA法測定濃度為1．5mg／mL。2．8WesternBlot分析多克隆抗體的特異性經(jīng)WesternBlot分析，多克隆抗體能與Sap2蛋白特異性結(jié)合，在分子量約為41kD處有蛋白雜交帶。

3討論

白球絲毒力因子包括其黏附性、菌絲形成、表型轉(zhuǎn)換及胞外水解酶等。胞外水解酶中的Sap與白球絲的致病性密切相關(guān)，可水解宿主細(xì)胞的膜蛋白，通過黏附、入侵組織破壞宿主的防御系統(tǒng)來避免或抵御殺菌劑的進(jìn)攻。本研究從白球絲標(biāo)準(zhǔn)菌株SC5314中克隆出SAP2基因，與原核載體pMAL－c2x雙酶切后成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL－c2x／SAP2。載體的選擇對后期表達(dá)出大量可溶性蛋白至關(guān)重要。pMAL－c2x載體是一種高效的蛋白融合表達(dá)及純化系統(tǒng)，含有MBP的E．colimalE基因，其下游的多克隆位點有利于目的基因插入，利用tac強(qiáng)啟動子和malE翻譯的轉(zhuǎn)錄起始信號可以高效表達(dá)目的基因。我們選用了E．coliBL21（DE3）作為蛋白表達(dá)的宿主菌，此菌種具備ompT蛋白酶缺陷和Lon蛋白酶缺陷的特點，使得BL21（DE3）表達(dá)外源蛋白時，不但細(xì)胞裂解后的蛋白酶解作用降低，同時胞內(nèi)轉(zhuǎn)化也減少，從而提高蛋白表達(dá)水平。外源基因在E．coli中高表達(dá)時，為盡量避免包涵體出現(xiàn)，本研究摸索了IPTG濃度、低溫誘導(dǎo)、最佳溫度等影響融合蛋白表達(dá)效率的條件。于37℃用0．5mmol／L、1mmol／LIPTG分別誘導(dǎo)4、8、12h表達(dá)重組蛋白，得到的均為包涵體，將誘導(dǎo)溫度降至16℃，IPTG濃度降至0．2mmol／L，誘導(dǎo)時間延長至14h，得到了理想的誘導(dǎo)效果。為獲得高純度的目的蛋白，選用直鏈淀粉樹脂對帶MBP親和標(biāo)簽的融合蛋白進(jìn)行親和層析純化，并用生理緩沖液洗脫，避免了去污劑對蛋白活性的影響。一般來講，E．coli中合成的融合蛋白通常都是較好的免疫原，但目的蛋白N端MBP標(biāo)簽的存在，可能會影響其生物活性，故獲得天然的具有生物活性的靶蛋白，需要將標(biāo)簽去除，E．colimalE蛋白編碼序列下游是編碼Xa因子識別位點的序列，通過載體上帶有位點專一性的蛋白酶FactorXa切除MBP標(biāo)簽，獲得高純度融合蛋白，為下一步免疫動物制備多克隆抗體奠定基礎(chǔ)。單克隆抗體雖具備較高的特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性，但存在制備復(fù)雜、耗時、成本昂貴等缺點。與之相比，多克隆抗體制備周期短、成本低，制備方法快速、簡單，可廣泛應(yīng)用于檢測領(lǐng)域，具備良好的應(yīng)用前景。多克隆抗體成功制備的關(guān)鍵取決于抗原的質(zhì)量。抗體的高效價、高特異性與抗原的純度、濃度密切相關(guān)。

4結(jié)語

不帶任何標(biāo)簽，純度＞90％，濃度為6．5mg／mL，具備較強(qiáng)的免疫原性。單純使用免疫原免疫動物，免疫效應(yīng)低，聯(lián)合佐劑可增強(qiáng)機(jī)體對抗原的特異性免疫應(yīng)答，從而擴(kuò)大免疫應(yīng)答效應(yīng)。與不使用佐劑相比，使用佐劑抗原的劑量可減少10～20倍。免疫得到的抗血清經(jīng)純化后可提高特異性，有利于實驗室檢測Sap2抗原的研究。因為抗血清中含白蛋白等其他蛋白成分，可干擾抗體標(biāo)記反應(yīng)及抗原抗體反應(yīng)，應(yīng)進(jìn)行純化提取單一的IgG抗體成分。多克隆抗體純化方法包括硫酸銨沉淀法、凝膠過濾層析法、離子交換層析及親和層析法等。大量研究證明，親和層析法是一種最有效的生物活性物質(zhì)純化方法，與其他純化方法相比，除通過對抗體特異性吸附和分離就提純數(shù)百倍外，抗體在純化過程中得到濃縮，結(jié)合到親和配基后，其余能破壞蛋白成分的蛋白水解酶可以被去除，性質(zhì)更加穩(wěn)定，提高了活性回收率。

作者：陳果單位：北京職業(yè)技術(shù)學(xué)院